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第一部分RSV感染对糖皮质激素受体(GR)的影响目的:RSV是引起全球5岁以下婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒病原体。目前尚无有效疫苗预防与药物防治。RSV感染诱发的炎症对糖皮质激素治疗不敏感,机制尚不完全清楚。糖皮质激素发挥其抗炎效果通过调控糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors,GR)的表达转运。GR表达降低是糖皮质激素治疗不敏感的重要机制,RSV感染是否下调GR的表达导致糖皮质激素治疗不敏感尚不清楚。故此,本部分主要研究RSV感染对GR表达的影响。方法:收集RSV感染患儿住院第一天的NPAs标本及正常对照组NPAs标本,检测GR mRNA和蛋白表达水平;运用RSV和UV-RSV感染A549细胞及BEAS-2B细胞模型,检测GR mRNA和蛋白表达水平。结果:1.RSV感染患儿NPA中GR mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著降低(P<0.01);2.RSV感染A549细胞及BEAS-2B细胞后,GR mRNA和蛋白表达水平呈一个感染时间依赖性降低(P<0.05);3.UV-RSV对GR mRNA和蛋白表达水平无影响。结论:RSV活病毒感染可降低GR mRNA和蛋白表达水平。第二部分RSV感染后miR-29a的表达及其对GR mRNA表达水平的影响目的:miRNA是一类22nt大小的非编码RNA,可以调控基因的3’UTR,降低其mRNA的稳定性,介导mRNA降解。GR 3’UTR有多个miRNA结合位点,其表达可受miRNA的调控。软件预测发现GR3’UTR 1078-1084位点为miR-29a的靶标序列。miR-29a是一个上皮细胞源性的miRNA,文献报道RSV感染可升高miR-29a表达,也可降低GR mRNA水平,故我们推测RSV通过调控miR-29a表达降低GR mRNA表达水平。方法:检测RSV感染患儿和正常对照组NPAs中miR-29a的表达并分析其与GR mRNA和蛋白表达水平的相关性;建立RSV和UV-RSV感染A549细胞和BEAS-2B细胞感染模型,检测miR-29a的表达;敲减或过表达miR-29a后,检测RSV感染A549细胞和BEAS-2B细胞中GR mRNA和蛋白表达水平;进一步通过双荧光素酶报告系统验证GR是否为miR-29a的靶基因。结果:1.RSV感染患儿NPAs中miR-29a表达增高,且与GR mRNA及蛋白表达有显著相关性(P<0.01);2.RSV感染A549细胞和BEAS-2B细胞后,miR-29a呈一个感染时间与感染剂量依赖性增高(P<0.05);3.敲减或过表达miR-29a的表达显著恢复RSV感染对GR mRNA及蛋白的降低(P<0.05)。4.GR是miR-29a的一个靶基因。结论:RSV感染后上调miR-29a的表达,降低GR mRNA和蛋白表达水平。第三部分RSV感染后p53的表达及其对GR蛋白表达水平的影响目的:抑制miR-29a的表达只可部分恢复RSV感染对GR蛋白的降低,且使用MG-132蛋白酶抑制剂后可恢复GR蛋白表达,表明RSV对GR蛋白的抑制作用还存在其他机制。在细胞处于低氧状态时,GR蛋白降解主要通过与p53及Mdm2蛋白相互作用,启动Mdm2介导的泛素化途径降解。RSV感染可诱导宿主细胞呈一个低氧状态,故此我们推测RSV通过调控p53-Mdm2下调GR的蛋白表达。方法:检测RSV感染患儿和正常对照组NPAs中p53蛋白的表达并分析其与GR蛋白表达水平的相关性;建立RSV和UV-RSV感染A549细胞感染模型,检测p53蛋白表达水平及GR、p53和Mdm2三者之间的相互作用;抑制Mdm2的表达水平、磷酸化水平及与p53的相互作用,检测RSV感染的A549细胞中GR蛋白表达水平及GR、p53和Mdm2三者之间的相互作用。结果:1.RSV感染患儿NPAs中p53蛋白表达降低,且与GR蛋白表达有显著相关性(P<0.01);2.RSV感染A549细胞后,p53呈一个感染时间与感染剂量依赖性降低(P<0.01);3.抑制Mdm2的表达水平、磷酸化水平及与p53的相互作用可部分恢复GR蛋白表达水平(P<0.05)。结论:RSV感染后通过调控p53-Mdm2介导GR蛋白表达水平的下降。第四部分RSV NS1蛋白在调控GR表达的作用机制研究目的:NS1基因位于RSV基因组3’端,是早期表达最多的基因和蛋白,介导着多种与宿主细胞相互作用的生物学功能。RSV NS1蛋白可上调miR-29a介导IFNR1的降低,还可激活PI3K-Akt信号通路。PI3K-Akt信号通路激活后可磷酸化Mdm2降解p53。NS1蛋白是否是RSV感染降低GR表达的最重要蛋白及NS1是否通过调控miR-29a及p53-Mdm2介导GR的降低尚不清楚。故本部分的研究目的为:1.证实NS1是否可降低GR表达;2.进一步证实NS1是否是通过调控miR-29a及p53-Mdm2降低GR表达。方法:建立RSV感染A549细胞感染模型,测定不同时间点RSV编码的10个基因的表达水平;si RNA敲低NS1基因表达后,检测GR mRNA、GR蛋白、miR-29a及p53蛋白表达水平;进一步在NS1基因敲低后:过表达miR-29a,检测GR mRNA、GR蛋白及其转录调控的FKBP51、GILZ mRNA表达水平;过表达Mdm2后,检测p53蛋白、GR蛋白及其转录调控的FKBP51、GILZ mRNA表达水平;进一步检测RSV感染患儿中NS1基因表达并分析其与GR mRNA、GR蛋白、miR-29a、p53蛋白表达水平的相关性。结果:1.在早期RSV感染A549细胞模型中,RSV编码的10个基因中,NS1基因是表达最多的;2.NS1基因敲低后可恢复GR mRNA、GR蛋白、miR-29a、p53蛋白的表达水平(P<0.05);3.NS1基因敲低后:过表达miR-29a可降低GR mRNA、GR蛋白及FKBP51、GILZ mRNA表达水平(P<0.05);过表达Mdm2后,p53蛋白、GR蛋白及FKBP51、GILZ mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论:RSV NS1通过上调miR-29a及调控p53-Mdm2介导GR mRNA和蛋白的降解。