小鼠干细胞作为重要生物材料在胚胎发育和临床治疗等研究方面具有重大理论和运用价值。Oct4作为核心转录因子,对干细胞的自我更新和多能性维持具有重要调控作用。Oct4转录因子控制早期胚胎的发育和分化,在多种干细胞中高表达,包括生殖细胞、胚胎干细胞(ESCs)、胚胎生殖细胞(EGCs)和胚胎肿瘤细胞(ECCs)。在小鼠中,Oct4在细胞多能性调节网络中起核心作用。通过异位表达转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,可以将体细胞重编程为诱导多能干细胞(i PSCs)。人OCT4基因可以选择性剪接成OCT4A、OCT4B和OCT4B1。但是,关于Oct4剪接体的功能研究迄今尚不充分。本研究以小鼠多能干细胞为研究对象,通过不同方法对Oct4基因剪接体的表达进行鉴定,并对Oct4b基因剪接体的功能进行分析研究。具体结果如下:1.小鼠Oct4基因的生物信息学分析利用生物信息学方法对Oct4基因检索、比对和分析发现,小鼠Oct4基因的不同剪接体定位于17号染色体上,并且Oct4a和Oct4b具有相同的2-5外显子。Oct4a和Oct4b的剪切主要发生在外显子1和内含子1区域,导致它们具有不同的5’端。对Oct4a和Oct4b上游起始区的顺式作用元件和可能结合转录因子分析发现,Oct4a和Oct4b可能存在不同的转录调节方式。而Oct4蛋白的保守性分析揭示,其在物种间的进化上具有保守性。通过转录数据库检索发现,小鼠Oct4在生殖细胞和胚胎干细胞中高表达。根据文献报道,小鼠Oct4b可能包含4个不同的翻译起始位点。2.小鼠Oct4基因剪接体的鉴定本研究设计了几组特异性引物用于检测小鼠多能干细胞中Oct4及其剪接体的表达。结果显示,除了已报道的Oct4b’和Oct4b之外,同时还检测到新的可变剪接体Oct4b1、Oct4b2和Oct4b3。与Oct4b相比,Oct4b1含有未被剪切的内含子2。Oct4b2与Oct4b1相比,含有一个额外的内含子4,而Oct4b3直接来源于未被剪切的基因组序列。通过对比不同细胞中Oct4剪接体的表达模式发现,Oct4b和Oct4a只在多能干细胞中表达,且Oct4b的表达量明显低于Oct4a。蛋白免疫印迹和免疫荧光结果显示,Oct4蛋白在小鼠多能干细胞中产生多个蛋白条带,且Oct4蛋白在ESCs和ECCs中的表达和定位有差异。进一步研究显示,培养条件中的血清浓度影响ECCs中Oct4蛋白的表达。不同Oct4抗体的研究结果显示,Oct4蛋白包括两种不同的细胞定位和剪切方式。3.小鼠Oct4b的蛋白表达和定位为了进一步准确说明小鼠Oct4b蛋白的表达和定位,我们构建了包含His标签蛋白的真核表达载体。结果显示,Oct4b可以通过选择性起始翻译形成246aa、221 aa和189 aa等三种蛋白,而Oct4b’只形成一种189 aa的蛋白。Oct4b2和Oct4b3可以通过选择性剪切成Oct4b和Oct4b’,然后翻译形成同样大小的蛋白。Oct4b同样可以剪切成Oct4b’,而Oct4b’作为最终剪切体不再进行剪切。Oct4b蛋白在不同模式细胞中的表达模式有差异。通过免疫染色发现,Oct4b蛋白主要定位于细胞核。4.小鼠Oct4基因剪接体的功能分析Oct4b序列5’端的内部核糖体插入位点(IRES)元件不仅可以选择性起始翻译形成不同的Oct4b蛋白,它还具有一定的启动子活性。通过转染不同的模式细胞,结果显示小鼠Oct4b的IRES元件在多能和非多能细胞系中的翻译表达模式存在差异性。通过对比不同多能细胞分化时Oct4b剪接体的表达变化,结果显示随着Oct4a的表达下降,Oct4b剪接体的表达量也明显下降。在mi PS细胞多能状态轻微下降时,Oct4a的表达和AP染色无法准确显示细胞多能状态的差异,而Oct4b’可以作为一个更精确的多能性标记基因。