论文部分内容阅读
[目 的]前列腺癌（Prostatecancer,PCa）发病率占男性恶性肿瘤的第二位,是男性因癌症死亡的第二大原因,仅次于肺癌。近年来,随着中国人生活方式的改变,前列腺癌的发病率也在迅速上升,但前列腺癌的具体发病机制和病因在很大程度上仍未得到明确解释。而RPS15A作为RP基因家族的一员,在肿瘤细胞生物学功能调节中的研究逐年增多,且已证实RPS15A在大多数肿瘤组织及细胞中高表达,并在肿瘤的发生发展中起着关键作用。而RPS15A在前列腺癌中的表达及作用未见报道。故本研究旨在探讨RPS15A在前列腺癌组织和正常前列腺组织中的表达情况及其与临床病理资料的相关性;其次探究RPS15A基因表达对前列腺癌DU145和PC-3细胞生物学功能的影响。[方 法]1.通过癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库分析RPS15AmRNA在前列腺癌组织和正常前列腺组织中的表达情况;2.通过免疫组化实验检测组织芯片（含159例前列腺癌组织及80例正常前列腺组织）中RPS15A蛋白的表达情况,并分析RPS15A蛋白表达与前列腺癌患者年龄、远处转移、PSA值、T分期、淋巴结转移、临床分期、Gleason分级之间的相关性;3.根据RNA干扰序列设计原则和设计软件评估测定后,选取shRPS15A-1、shRPS15A-2、shRPS15A-3三组序列作为干扰系列,将前列腺癌DU145细胞分别转染含三组不同RNA干扰序列的慢病毒,采用qPCR筛选对RPS15A基因最有效的干扰系列;4.将筛选出的RNA干扰系列转染DU145和PC-3细胞,显微镜下荧光监测细胞转染效率;通过qPCR和Wb分别于RNA水平及蛋白水平验证DU145和PC-3细胞转染效率;5.通过细胞克隆形成实验和Celigo细胞计数实验检测敲低RPS15A基因对前列腺癌DU145和PC-3细胞增殖的影响;6.通过划痕实验和Transwell侵袭实验检测敲低RPS15A基因对前列腺癌DU145和PC-3细胞体外迁移和侵袭的影响;7.通过流式细胞术检测敲低RPS15A基因对前列腺癌DU145和PC-3细胞凋亡的影响。[结 果]1.基因表达谱分析基于TCGA数据库中RNAseq数据（包含498例前列腺癌组织以及52例正常前列腺组织样本）,结果显示RPS15A在前列腺癌组织中表达量的中位数、25%分位数和75%分位数均大于正常前列腺组织;2.免疫组化实验检测组织芯片（含159例前列腺癌组织及80例正常前列腺组织）中RPS15A蛋白的表达情况表明,RPS15A蛋白在前列腺癌组织中的表达明显高于正常前列腺组织（P<0.001）。统计分析表明RPS15A蛋白的表达与肿瘤浸润深度（T分期）存在显著性差异（P<0.05）,RPS15A蛋白的表达与年龄、远处转移、PSA值、淋巴结转移、临床分期、Gleason分级均无显著性差异（P>0.05）。同时,相关性分析表明RPS15A蛋白的表达与肿瘤浸润深度（T分期）呈正相关;3.qPCR筛选有效干扰系列结果显示,含三组不同RNA干扰序列的慢病毒转染前列腺癌细胞DU145,相对于对照组（shCtr1）,shRPS15A-2组和shRPS15A-3组RPS15A基因敲减效率无明显变化（p>0.05）,shRPS15A-1组RPS15A基因敲减效率达到83.6%（p<0.001）,故后续采用含shRPS15A-1组干扰系列的慢病毒进行实验;4.前列腺癌DU145及PC-3细胞在慢病毒感染72小时后,荧光显微镜下观察,观察结果显示实验组（shRPS15A）和对照组（shCtr1）细胞感染效率达到80%以上,细胞生长良好;qPCR和Wb验证结果显示,DU145和PC-3细胞经慢病毒感染后,与对照组相比,RPS15A基因敲低效率分别为51.9%（P<0.001）和91.8%（P<0.01）,且RPS15A蛋白表达水平均下调;5.克隆形成实验显示,DU145和PC-3细胞经慢病毒感染后,细胞克隆数减少,统计结果分别为P<0.01和P<0.001;Celigo细胞计数实验显示,PC-3细胞和DU145细胞经慢病毒感染后,细胞计数值的增长和细胞增殖倍数的变化缓慢,细胞增殖明显被抑制（p<0.001）;6.划痕实验结果表明,DU 145细胞PC-3细胞感染慢病毒后,与对照组比较,细胞迁移率分别降低27%（P<0.001）和53%（P<0.01）;体外侵袭实验结果表明,DU 145细胞PC-3细胞感染慢病毒后,与对照组比较,细胞转移率分别降低 56%（P<0.001）和 85%（P<0.001）;7.流式细胞术检测结果显示,DU145细胞和PC-3细胞经慢病毒感染后,相比对照组,细胞凋亡数增多（P<0.001）。[结 论]1.RPS15A基因在前列腺癌组织中的表达明显高于正常前列腺组织,其表达与肿瘤浸润深度呈正相关,随患者肿瘤浸润程度加深,RPS15A基因的表达随之增加,提示RPS15A基因可能与前列腺癌的发生发展相关。2.RPS15A基因可显著促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制前列腺癌细胞的凋亡。