背景毛囊是具有高度再生功能的皮肤附属器官,持续经历着生长期、静止期、退行期的循环生长过程,毛发的生长依赖于毛囊的这种周期性活动。毛囊所生长出的毛发除了调节体温、分泌与排泄等基本功能外,还有影响外貌的美观作用。所以由衰老、疾病、创伤、疾病等因素引起的的脱发作为一种临床常见疾病,严重影响着人们的心理和社交活动。目前治疗脱发的方法主要分为药物治疗和毛发移植手术,药物包括外敷使用的米诺地尔和口服的非那雄胺,米诺地尔是非特异性治疗脱发的药物,总体有效率大约在30%-50%之间,长期使用可导致过敏、多毛症等;非那雄胺仅仅适用于治疗男性雄激素源性脱发,于其他类型脱发并无适用征。毛发移植术是将求美者枕后部的毛囊移植到目标区域,使毛囊重新分布,对于供发区的毛囊单位数量有一定要求。因此无论是药物治疗还是手术治疗都不能增加毛囊数量,为了更好的解决毛发绝对稀少求美者的脱发问题,通过组织工程方式实现体外毛囊单位重建来解决脱发严重求美者毛囊数量不足的问题,成为了解决问题的关键。种子细胞,生长因子,支架材料是组织工程技术的三大要素。毛囊的形成是基于毛囊真皮成分的毛乳头细胞和上皮成分的外根鞘细胞间的相互作用,位于毛囊球部的毛乳头是毛囊自我更新的源泉。这也就是说毛乳头细胞具有维持诱导上皮细胞增殖分化形成毛囊,促进毛发生长发育和调节毛囊周期循环的能力,被认为是毛囊重建的最佳种子细胞。研究证实毛乳头细胞的毛囊诱导能力与其聚集性生长的特性密切相关,然而在体外二维培养时,随着传代次数的增加,毛乳头细胞会逐渐丧失其毛囊诱导的能力。因此,在体外扩增的同时维持毛乳头细胞的毛囊诱导能力是毛囊重建的关键。生理状态下,几乎所有体细胞均生长于由胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白、糖蛋白、生长因子等组成的细胞外基质,细胞外基质为细胞提供了天然的细胞微环境,在调控细胞行为例如细胞存活、增殖、形态发生、迁移和分化方面发挥着重要作用。细胞外基质通过其三维结构特点以及其内含有的生长因子和信号通路等实现与细胞的交互,决定着细胞的命运。人体内正常的毛乳头细胞就是由细胞外基质呈现包裹聚集性生长,形成直径为150～250 μm的乳头状结构。据此,我们认为可将细胞外基质制备为细胞培养的支架,在其上进行毛乳头细胞培养时或许可以维持其凝集生长及毛囊诱导的特性。由于细胞外基质的结构组织和成分比较复杂,现阶段很难在体外模拟细胞外基质微环境。脱细胞技术的出现和发展,使得制备脱细胞基质支架材料成为解决这一问题的可能,受到了广泛关注。脱细胞支架材料是通过物理、化学、酶处理或者三者的结合彻底去除组织的细胞成分,同时最大程度保持细胞外基质组成和功能的完整性。目前在皮肤、脂肪组织再生领域,脱细胞基质材料已获得良好效果,但在毛囊再生领域未见相关报道。目的本研究以人胎盘为基础,通过冻融、化学试剂洗脱、酶消化等处理后制备脱细胞胎盘水凝胶作为细胞三维培养的支架,观察人毛乳头细胞在该水凝胶上培养时的生长情况,并探究其对毛乳头毛囊诱导特性的影响。方法1.脱细胞胎盘水凝胶体外三维培养毛乳头细胞模型的构建参照Francis[21]的方法,取孕妇分娩后的完整胎盘,通过冻融、机械振荡、化学试剂洗脱、酶消化制备温度敏感性脱细胞胎盘水凝胶。在无菌操作台中用剪刀将胎盘剪碎至约5mm小块,置于-80℃冰箱过夜后取出放置在4℃冰箱使其缓慢溶解,溶解后置于N-Ethylmaleimide/N-laurylsarcosine洗涤溶液中彻底清除细胞成分。脱细胞后的胎盘组织置于胃蛋白酶/盐酸溶液消化并调整PH至中性后得而到的胎盘水凝胶溶液放置4℃冰箱备用。取毛发移植术患者术后多余毛囊作为标本,对其进行初步处理后,采用酶消化法和显微解剖法分离DP,将从毛囊球部分离的DP转移至培养皿中,培养皿置于37℃恒温、二氧化碳浓度5%细胞培养箱中培养。可见有细胞迁出后换完全培养基进行培养,细胞达80%融合时用0.25%胰蛋白酶消化,按1:2比例传代,取传代的第2代细胞做为阳性对照组,第8代细胞做阴性对照组及实验组所用细胞。将胎盘细胞外基质提取液按照50 μL/孔的标准接种于96孔培养板后置于37℃恒温、二氧化碳浓度5%培养箱中约15至30分钟,待其成胶后,取第8代毛乳头细胞按照1X104个/孔的数量接种于已被脱细胞胎盘水凝胶包被的96孔培养板中,光镜下观察细胞生长情况。活死染色检测胎盘胶培养时DPC的生长活性。2.脱细胞胎盘水凝胶体外三维培养毛乳头细胞模型的检测和评价取第2代DPC进行常规二维培养,第8代DPC分别进行二维培养和脱细胞胎盘水凝胶接种,分别检测不同组中DPC的毛囊诱导特性:qRT-PCR法检测versican、ALP和β-catenin的基因表达情况;免疫荧光染色法定性检测versican、ALP和β-catenin的蛋白表达情况;免疫印迹法定量检测versican、ALP和β-catenin的蛋白表达情况。3.脱细胞胎盘水凝胶三维培养毛乳头细胞球移植后的体内毛囊重建采用酶消化分离获得新生鼠皮肤的表皮细胞,按以下分组进行注射移植以重建毛囊:（1）阳性对照组:表皮细胞+2D-P2-DPC;（2）实验组:表皮细胞+HPECM-P8-DPC细胞球;（3）阴性对照组:表皮细胞+2D-P8-DPC;注射移植3周后对移植部位取材,对移植部位进行大体观察及组织切片HE染色验证体内毛囊诱导再生能力。结果1.脱细胞胎盘水凝胶体外三维培养毛乳头细胞模型的构建采用显微解剖结合酶消化的方法获得的DP形态完整,呈卵圆形或梨形,迁出生长的DPC呈长梭形;培养的DPC聚集性生长的特性随着传代次数的增加而逐渐丧失。DPC以1× 104/孔的细胞数量接种于脱细胞胎盘水凝胶上培养时,细胞表现出相互聚集生长的趋势,培养至第三天时,细胞聚集成DPC细胞球,此后随着培养时间的延长,DPC球外观未见明显改变,稳定生长。活死染色结果显示,DPC细胞球在胎盘胶上培养时生长活性良好,说明胎盘胶具备良好的生物相容性。2.脱细胞胎盘水凝胶体外三维培养毛乳头细胞模型的检测和评价qRT-PCR、免疫荧光和免疫印迹对DPC毛囊诱导特异标记物versican、ALP和β-catenin的基因和蛋白表达检测结果显示:高传代（P8）在传统二维培养条件下,上述标记物的表达基本丧失;而当高传代（P8）DPC通过脱细胞胎盘水凝胶进行三维培养形成DPC细胞球后可恢复和维持以上标记物的表达。3.脱细胞胎盘水凝胶三维培养毛乳头细胞球移植后的体内毛囊重建高传代（P8）DPC经脱细胞胎盘水凝胶三维培养形成DPC细胞球后与新生鼠表皮细胞联合移植可重建出完整的毛囊结构,而传统二维条件培养下的高传代（P8）DPC与新生鼠表皮细胞联合移植则未能重建出毛囊结构。结论1.通过脱细胞处理和酶消化技术制备的脱细胞胎盘水凝胶可作为仿生支架应用,与传统二维培养相比,脱细胞胎盘水凝胶并未影响DPC的细胞活性。2.通过脱细胞胎盘水凝胶培养模型培养的高传代DPC细胞球,可以恢复和维持DPC毛囊诱导相关标记物versican、ALP和β-catenin的表达,表明脱细胞胎盘水凝胶给DPC提供了良好的生长微环境,维持了 DPC的毛囊诱导特性。3.通过脱细胞胎盘水凝胶培养模型培养的高传代DPC细胞球,不仅能恢复DPC诱导毛囊再生的能力,还可用于体内毛囊重建。