目的恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,在各种疾病所致的死亡中,恶性肿瘤已成为主要病因,并有进一步增高的趋势。目前传统治疗方法如手术、放疗和化疗虽有一定疗效,但却十分有限,常难以彻底消灭肿瘤细胞。而免疫治疗特别是肿瘤疫苗的研究日益受到人们的重视,显示出良好的应用前景,为肿瘤治疗带来了新的希望,其中exosomes亚细胞疫苗的研制成为目前肿瘤治疗研究的热点之一。Exosomes是由细胞分泌至胞外的膜性小囊泡,人们早于1987年发现exosomes,但是直至最近几年有关exosomes基础与临床的研究才得到更多的关注,这主要归因于它的抗肿瘤作用的发现。目前,exosomes的研究进入了一个新的阶段,对其功能有了更多的认识,发现其作用并不限于诱导免疫应答以及抗肿瘤作用,此外还能够诱导免疫耐受。因此,研究肿瘤来源的exosomes对肿瘤细胞增殖的影响及其在免疫方面的作用机制可为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号转导通路和细丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中起关键作用,近年来发现与人类肿瘤的发生发展密切相关。但PI3K/Akt和MAPK/ERK通路在exosomes促进肿瘤细胞增殖和诱导T细胞凋亡中的作用目前尚未见报道。Cbl家族蛋白(Cbl-b和c-Cbl)是一种高度保守的RING家族E3泛素连接酶,在维持T细胞稳态和免疫耐受方面发挥着重要作用。研究表明它不仅能设定T细胞活化的阈值,而且能通过特异性地选择底物蛋白启动泛素化降解途径而参与细胞内信号转导的负向调控。目前越来越多的证据表明E3泛素连接酶Cbl-b(Casitas Blineage lymphoma-b)在T细胞CD3激活诱导的细胞死亡中起重要作用,但关于Cbl蛋白在exosomes诱导的T细胞凋亡中的作用不清楚。本课题以胃癌SGC7901细胞为模型,分离出肿瘤细胞来源的exosomes,初步观察了其对肿瘤细胞增殖和T细胞凋亡的影响,并对PI3K/Akt、MAPK/ERK通路及其上游分子泛素连接酶Cbl家族蛋白在此过程中的调控机制进行了探讨。材料与方法1、采用离心超滤和蔗糖密度梯度离心的方法从胃癌SGC7901细胞的上清液中分离出肿瘤来源的exosomes。2、透射电子显微镜下观察exosome形态。3、采用MTT法和台盼蓝拒染法测定细胞活力,绘制增殖曲线。4、采用流式细胞仪PI染色检测细胞凋亡。5、采用瑞氏-姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态学变化。6、采用Western blot检测蛋白的表达。7、统计学处理:每次实验重复3次,数据以(?)±s表示,采用SPSS13.0软件进行t检验。实验结果1、采用离心超滤和蔗糖密度梯度离心的方法从胃癌SGC7901细胞的上清液中分离出肿瘤来源的exosomes。透射电子显微镜下观察exosomes具有特征性的盘状结构,由双层膜构成,它们的直径在30-100 nm之间。Western blot结果显示和等量的SGC7901细胞裂解物相比,exosomes表面富含HLA-A、CD9和TSG101分子。2、SGC7901细胞来源的exosomes以时间和剂量依赖性的方式促进SGC7901细胞和BGC823细胞的增殖。200μg/ml和400μg/ml的exosomes处理SGC7901细胞72 h,细胞的增殖比率分别是对照组的142%和145%;处理BGC823细胞72 h,细胞的增殖比率分别是对照组的129%和138%。3、Exosomes以时间和剂量依赖性的方式上调p-Akt和p-ERK1/2的表达,200μg/ml的exosomes作用于SGC7901细胞72 h后,p-Akt和p-ERK1/2的表达水平分别是对照组的3.52和3.16倍。10μM LY294002预处理SGC7901细胞1 h阻断PI3K/Akt信号通路的活性后,再加入200μg/ml的exosomes继续作用72 h,能使p-Akt的表达恢复至基线水平。同样,10μM PD98059预处理SGC7901细胞1 h阻断MAPK/ERK的活性后,再加入200μg/ml的exosomes继续作用72 h,能逆转exosomes诱导的ERK1/2的活化。相应的MTT结果显示LY294002和PD98059能部分逆转exosomes的促增殖作用。4、200μg/ml的exosomes作用于SGC7901细胞24、48和72 h,Western blot结果显示,exosomes能下调Cbl-b和c-Cbl的表达,24 h时两者的表达水平轻度下调(分别是对照组的0.78和0.85倍),72 h时下调最明显(分别是对照组的0.35和0.09倍)。进一步的研究发现exosomes下调Cbl-b和c-Cbl的表达存在剂量依赖性。5、不同浓度的exosomes作用于Jurkat T细胞(3×10~5/ml)24、48和72 h。台盼蓝拒染法显示exosomes以时间和剂量依赖性的方式抑制Jurkat T细胞增殖。流式细胞仪分析显示不同浓度的exosomes作用于Jurkat T细胞48 h后,exosomes能诱导Jurkat T细胞凋亡。400μg/ml的exosomes作用于Jurkat T细胞48 h后,有31.76%的细胞发生了凋亡,而对照组仅有2.47%的细胞发生凋亡(p＜0.01)。同时瑞氏-姬姆萨染色可见典型的凋亡形态改变,表现为细胞膜完整,细胞质固缩,胞核固缩或碎裂,可见凋亡小体。400μg/ml的exosomes分别作用于Jurkat T细胞24和48 h,Western blot结果显示exosomes作用24h能检测裂解的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9片段,48 h时更明显。6、400μg/ml的exosomes分别作用于Jurkat T细胞24和48 h,Western blot结果显示,exosomes能上调Cbl-b和c-Cbl的表达,24 h时两者的表达水平轻度上调(分别是对照组的1.10和1.23倍),48 h时明显上调(分别是对照组的2.04和1.86倍)。进一步检测Cbl蛋白的下游分子Akt,发现exosomes以时间依赖性的方式下调p-Akt的表达,且p-Akt表达的下调与Cbl蛋白表达的上调同时发生。用蛋白酶体和Cbl蛋白的功能性抑制剂PS-341抑制Cbl泛素连接酶的功能。结果显示,10 nM PS-341预处理Jurkat T细胞4 h,然后加入终浓度为400μg/ml的exosomes,继续培养48 h后细胞凋亡较单纯exosomes组明显减少,同时Western blot结果显示PS-341部分逆转了exosomes下调p-Akt表达的作用。结论1、离心超滤和蔗糖密度梯度离心纯化exosomes方法可行。胃癌SGC7901细胞来源的exosomes为直径在30-100 nm之间的囊性小泡,表达HLA-A、CD9和TSG101分子。2、胃癌SGC7901细胞分泌的exosomes能以时间和剂量依赖性的方式促进SGC7901和BGC823细胞增殖3、Exosomes在促进胃癌SGC7901细胞增殖过程中上调了p-Akt和p-ERK的表达。抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的活性可部分逆转exosomes促进SGC7901细胞增殖的作用。提示激活PI3K/Akt和MAPK/ERK通路是exosomes促进肿瘤细胞增殖的机制之一。4、Exosomes在促进胃癌SGC7901细胞增殖过程中下调了Cbl-b和c-Cbl的表达。5、胃癌SGC7901细胞来源的exosomes能抑制Jurkat T细胞的增殖,并诱导JurkatT细胞凋亡,在凋亡过程中伴有Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化。6、胃癌SGC7901细胞来源的exosomes在诱导Jurkat T细胞凋亡过程中上调了Cbl-b和c-Cbl蛋白的表达,同时下调了p-Akt的表达。用PS-341抑制Cbl蛋白的功能能部分逆转Akt的活性和exosomes诱导Jurkat T细胞凋亡的作用。