纳豆激酶分离、纯化及其酶学性质研究

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血栓性疾病是一种危害人类健康的重大疾病,每年因血栓性疾病致死的人数约占世界总死亡数的四分之一。而目前上临床使用的溶栓制剂存在诸多缺点,如:价格昂贵、半衰期短、稳定性差、易引发出血等。因此,研究开发新型溶栓制剂迫在眉睫。纳豆是一种日本传统的发酵食品,经研究含有大量的生物活性物质,具有抗栓、降血压、抗菌、预防癌症等多种生理功能,但发酵成熟的纳豆因其具有特殊的氨味而不被大多数人所接受。选取合适的发酵底物,优化发酵条件,开发新的产品是十分必要的。纳豆激酶是纳豆发酵过程中产生的一种高效血栓溶解酶,来源于传统的发酵食品,生产工艺相对简单,因为价格低廉,且溶栓性能良好,很有希望发展成为新一代溶栓药物。本论文选取花生作为发酵底物,对纳豆花生发酵条件进行优化,研究粗酶液的抑菌性能以及对纳豆激酶进行分离纯化和酶学性质的研究,最终所得结果如下:1通过单因素试验及正交试验,确定纳豆花生最佳发酵条件为:蔗糖添加量2%,NaCl添加量1%,接种量2%,含水量35%,发酵温度37℃,发酵时间24h,在最佳发酵条件下的产酶量为2725U/g(湿重),具有较高的纳豆激酶活性,且发酵成熟的纳豆花生不但没有氨味,具有一种花生所特有的香味,能被大多数人所接受;2采用牛津杯法研究发酵粗酶液对常见指示菌的抑制情况,其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌及根霉、青霉和曲霉抑制效果最为明显。3采用硫酸铵分级盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析对纳豆激酶进行分离纯化,结果表明:25%和60%饱和度的硫酸铵对除去杂质蛋白和沉淀纳豆激酶作用最为明显,最终纯化倍数为33.19,回收率为12.39%,SDS-PAGE电泳检测为单一蛋白条带;4对纳豆激酶的酶学性质进行了初步的研究,结果表明:纳豆激酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为8.5,纳豆激酶没有明显的金属离子激活剂,大多数金属离子不同程度的抑制其活性,Cu2+和Hg2+抑制作用最为明显,EDTA、DTT和SDS对酶活没有明显的影响,PMSF能够完全抑制纳豆激酶的活性,证明该酶是一种丝氨酸蛋白酶;5对纳豆激酶的抗凝和溶栓作用进行了初步的研究,结果表明:加入纳豆激酶的新鲜血液在实验观察的2h内并未发生凝固;加入纳豆激酶酶液的血块,4h后的溶解率可达到82.13±1.06,说明纳豆激酶具有很好的溶栓性能,为纳豆激酶发展成为一种新型溶栓制剂提供了理论依据。
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