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研究背景间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）具有很强的自我增殖能力,且在一定条件下具备向多种类型细胞的分化能力,是机体损伤后自我修复的重要组成部分,在再生医学领域发展前景广阔。间充质干细胞最早发现于骨髓,随后在脐带、脐血、胎盘、脂肪、牙周质、肌肉等组织中均有发现。目前,研究最多且在临床应用较为广泛的是脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）和骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,特别是ADSCs,因为其来源广泛,成体也可方便提取,因此在整形美容抗衰老领域,ADSCs已广泛应用于面部软组织凹陷的填充,皮肤年轻化,面部皱纹的改善,自体脂肪隆胸隆臀,难愈性创面的修复等方面,但是ADSCs也存在一定的缺点和局限性:成人干细胞活性有限,多代培养后衰老明显,而某些创面患者年龄偏大又影响了 ADSCs的活性;免疫原性较强,目前仅能自体应用;多向分化能力不如胚胎或胎儿时期干细胞强。而同成人间充质干细胞相比,胎儿间充质干细胞具有以下优势:细胞自我增殖能力更强,且多代增殖后衰老速度更慢,多向分化能力更强,而且免疫原性更低。胎儿真皮间充质干细胞（Fetal dermal mesenchymal stem cells,FDMSCs）提取自意外流产的孕中期胎儿真皮组织,在皮肤再生修复领域以及皮肤年轻化抗衰老领域具有潜在的优势。对于间充质干细胞的作用方式,许多研究结果都表明干细胞主要通过旁分泌功能发挥作用,干细胞可以向细胞外释放生长因子、细胞因子、炎症趋化因子、调节肽、特异性活性因子、外泌体等一系列生物活性物质,通过这些介质的作用起到各种各样的生物学作用。而干细胞的条件培养基（Conditioned medium,CM）含有以上各种介质,是用来研究干细胞作用的重要手段。近年来,机体或者细胞的抗衰老研究引起学者们广泛的关注和深入研究,其中在整形美容领域,皮肤的抗衰老研究引人注目。D-半乳糖在细胞衰老模型和动物衰老模型建立中广泛应用,其加速衰老的机制非常复杂,尚未完全研究清楚。而FDMSCs在抗衰老方面的研究还是空白,故而进行本课题的研究。研究目的利用D-半乳糖建立成人真皮成纤维细胞（Adult dermal fibroblasts,ADFs）衰老模型和小鼠背部皮肤衰老模型。提取FDMSCs,制备胎儿真皮间充质干细胞条件培养基（FDMSCs-CM）,研究FDMSCs-CM对ADFs功能的影响,及其在细胞水平抗衰老作用,利用FDMSCs皮下注射治疗衰老小鼠皮肤,研究其在动物实验中的抗衰老作用。检测细胞内活性氧水平、p16、p21、p53基因表达等指标,阐明FDMSCs抗衰老作用的可能机制。研究方法1.提取FDMSCs。从胎儿真皮组织中用酶消化法提取FDMSCs,进行成脂、成骨、成软骨三系分化诱导,并进行细胞表面标记物检测。2.提取ADFs。从成年人包皮真皮组织中用酶消化法提取ADFs,进行Vimentin免疫荧光检测。3.制备 FDMSCs-CM。4.研究不同浓度D-半乳糖对ADFs的作用,采用CCK-8实验和EdU结合实验观察ADFs增殖情况,建立ADFs衰老模型。5.研究FDMSCs-CM和D-半乳糖共同作用时ADFs的情况,观察FDMSCs-CM对ADFs增殖的影响,研究其是否具有细胞水平抗凋亡和抗衰老作用。6.研究D-半乳糖对ADFs细胞内活性氧含量的影响,以及FDMSCs-CM干预以后的作用。7.研究40g/L D-半乳糖对ADFs内p16、p21、p53基因表达的影响,以及FDMSCs-CM干预以后的作用。8.动物实验。利用D-半乳糖皮下注射构建小鼠背部皮肤衰老模型。9.利用荧光素酶基因慢病毒转染法研究FDMSCs在小鼠背部存活时间。10.FDMSCs皮下注射干预衰老组Ⅱ小鼠,观察干细胞的抗衰老作用。11.FDMSCs注射2周后麻醉剃毛拍照,然后处死小鼠取背部皮肤行HE和MASSON染色观察皮肤组织情况,另一部分皮肤做成匀浆行检测皮肤衰老相关的成分含量:超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（HYP）、晚期糖基化终末化产物（AGEs）。研究结果1.成功提取并鉴定FDMSCs。2.成功提取并鉴定ADFs。3.制备获得FDMSCs-CM。4.D-半乳糖可以抑制ADFs增殖,且抑制作用随着浓度增加而增加。5.高浓度D-半乳糖可明显诱导ADFs凋亡。6.FDMSCs-CM可在一定程度上对抗高浓度D-半乳糖诱导的ADFs凋亡。7.FDMSCs-CM促进ADFs增殖,且可对抗中低浓度D-半乳糖对ADFs增殖的抑制作用。8.40g/L的D-半乳糖可以诱导ADFs中衰老相关的β半乳糖苷酶染色增加,显著抑制ADFs增殖,从而建立ADFs衰老模型。而FDMSCs-CM可以部分改善ADFs衰老情况。9.D-半乳糖可诱导ADFs细胞内ROS含量增加,且呈浓度相关性,FDMSCs-CM可在一定程度内减少ROS的增加。10.40g/L D-半乳糖可诱导p16、p21、p53基因表达增加,FDMSCs-CM可部分逆转以上情况。11.D-半乳糖长时间皮下注射可诱导小鼠形成皮肤衰老模型。12.FDMSCs在KM小鼠皮下存活约10-11天时间。13.FDMSCs皮下注射可以减少衰老组小鼠皮肤皱纹,增加衰老组小鼠真皮厚度,增加真皮内胶原纤维含量,增强衰老组小鼠皮肤内SOD活力,降低MDA和AGEs含量,增加皮肤内HYP含量。研究结论1.40g/L的D-半乳糖可以抑制ADFs增殖,可诱导形成ADFs衰老模型。2.FDMSCs-CM可促进ADFs细胞增殖,可逆转40g/L的D-半乳糖诱导的ADFs衰老。3.80g/L的D-半乳糖可诱导ADFs凋亡,FDMSCs-CM能在一定程度上对抗这种凋亡。4.D-半乳糖可能通过增加ADFs细胞内ROS水平的氧化途径产生诱导衰老和凋亡的效果,进而使p16、p21、p53基因表达增加,FDMSCs-CM可部分逆转以上情况,说明FDMSCs在细胞水平主要通过抗氧化途径从而起到抗衰老的效果。5.D-半乳糖皮下注射可诱导形成小鼠皮肤衰老模型,而FDMSCs皮下注射具有一定的皮肤抗衰老作用,这种效果主要是通过旁分泌机制起作用。研究意义FDMSCs是一种较为新颖的间充质干细胞,国内外未见其抗衰老方面的文献报道,本实验首次利用D-半乳糖在一定浓度和诱导时间条件下建立ADFs衰老模型,并且证实FDMSCs-CM具有细胞水平抗衰老的作用。然后利用D-半乳糖建立了小鼠皮肤加速衰老模型,并且证实了 FDMSCs在免疫力健全的小鼠体内可以存活10天以上,而且发挥抗衰老功能,使衰老组小鼠皱纹减少、真皮厚度增加、胶原蛋白含量增多、各类衰老标记物含量减少。故而,本实验证实FDMSCs在细胞水平和动物水平都具备一定的抗衰老作用,其细胞水平抗衰老作用主要通过抗氧化途径实现,而动物水平抗衰老作用主要通过旁分泌机制起作用。本实验的研究结果预示着FDMSCs建立细胞库并以后推广各类临床应用的可能,具有极为重要的价值和意义。