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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种严重危害老年人健康的神经退行性病变，患者脑内病理特征为大脑皮层和海马的神经元缺失，细胞间淀粉样蛋白的沉淀和细胞内神经元纤维缠结。目前缺乏行之有效的治疗手段。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究为多种神经系统疾病的治疗带来了希望，通过调控神经干细胞增殖和分化，可以得到所需的不同类型的神经细胞，这样可为细胞移植的进行提供理想的供体细胞，被认为是神经退行性疾病及神经损伤性疾病最有前景的治疗策略之一 。目前在动物模型阶段的研究已取得一些进展 ,证实神经干细胞（NSCs）移植可以在动物模型体内增殖、分化，并改善模型动物的一些症状。 NSCs在体外可持续增殖 ,又具有很强的可塑性 ,使其成为细胞移植治疗AD病的理想选材。神经干细胞移植的成功与否，主要取决于神经干细胞能否在宿主成功存活，成功整合并分化为具有特定功能的神经细胞类型。而神经干细胞移植治疗AD病存在一定问题，有报道将神经干细胞移植到突变型淀粉样蛋白前体蛋白（APP）转基因AD模型鼠后，出现了不同程度的凋亡现象，神经干细胞不能有效的存活。研究认为，模型鼠体内的β淀粉样蛋白对植入的神经干细胞可能产生了毒性作用。另外，移植细胞的定向分化为神经元的比率也是一个重要问题。AD病人主要表现为神经元缺失，因此，如何调控移植后的神经干细胞定向分化为神经元的问题需要解决。只有解决NSCs的存活和定向分化问题,才能有效促进上述问题的解决,以实现细胞的替代治疗。Falk等报道神经干细胞的分化能被单个基因所调控，本实验的研究目的就是通过基因修饰神经干细胞以期达到解决上述问题的目的。Humanin(HN)是一种含24个氨基酸的多肽。已有的研究表明HN多肽能有效保护由Alzheimer病致病基因及Aβ引起的神经元细胞死亡，而对于亨廷顿舞蹈病（Huntington’s chorea）致病因素Q79多肽、肌萎缩性脊髓侧索硬<WP=5>化(amyotrophic lateral sclerosis)致病因素SOD1引起的神经细胞死亡， HN则无效。因此HN对AD相关致病因素具有特异性抑制作用。虽然如此， HN直接用于治疗AD病在目前还存在一定障碍，包括：（1）神经干细胞在早发AD的发病过程中也受到了抑制，而Humanin 对神经干细胞的作用仍不清楚；（2）由于生物体内血脑屏障的存在，同时，它在给药途径中存在被体内及血液中各种酶分解的可能性，Humanin很难达到作用部位；（3）AD病已经表现为神经元缺失，即使Humanin能达到脑内作用部位，也不可能填补已经丢失或凋亡的神经元细胞。如果能将神经干细胞作为载体，使其分泌表达Humanin，不但可能促进移植的神经干细胞的存活及移植分化，而且能有效抑制移植部位神经元的死亡，将为神经干细胞移植治疗AD病提供一个非常良好的细胞供体。为此，我们对HN对神经干细胞的影响作了以下研究，首先明确AβP1-42对神经干细胞的作用、Humanin对神经干细胞的作用，以及二者相互关系作用进行了研究。我们体外研究结果表明，低浓度（6(mol/L）的AβP1-42就可以抑制神经干细胞的分化，较高浓度（12.5(mol/L）的AβP1-42可以明显引起神经干细胞的凋亡；HN对神经干细胞的增殖以及向神经元的分化有促进作用，并且可以对抗AβP1-42抑制神经干细胞的分化及致凋亡的作用；其次，我们将Humanin基因转染神经干细胞，观察其对神经干细胞产生的影响及对Aβ的神经干细胞毒性作用，结果表明稳定表达humanin的神经干细胞克隆也能有效对抗AβP1-42对神经干细胞的毒性作用，同时明显提高加入血清所诱导神经干细胞向神经元分化的比率。现将实验内容分述如下：1.神经干细胞的培养鉴定及Aβ对神经干细胞的作用①采用无血清培养方法，在bFGF作用下培养细胞，用nestin、 MAP2、GFAP和Gal-C的免疫荧光染色技术分别鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞表型。结果原代与传代培养的细胞均可以形成悬浮生长的“神经球”，原代培养4-5天形成的Nestin阳性细胞团最多在5天内增殖较快，细胞可传代2个月以上而不分化。免疫荧光染色显示细胞克隆nestin强阳性，分化细胞中有MAP2，GFAP, Gal-C阳性细胞染色。②采用DMEM/F12<WP=6>＋B27+bFGF，DMEM/F12+ B27，RPMI1640/F12+B27+bFGF 和RPMI1640/ F12+B27四种无血清培养液条件，比较干细胞克隆形成数，观察细胞生长情况。结果表明在各培养条件下均能产生nestin阳性的细胞团，在DMEM/ F12（1:1），B27（10mg/l），bFGF（0.2ng/ml），条件下，细胞克隆形成率最高。③采用优化筛选的无血清培养基，比较不同胚龄（E13.5,E14, E15,E16, E17）来源的神经干细胞克隆形成数。结果E13.5,E14天来源的神经干细胞形成的克隆数较多，明显高于E15,E16, E17来源的细胞。通过比较，我们筛选出了神经干细胞适宜的生长条件及培养神经干细胞适合的胚龄来源。为了观察β-淀粉样蛋白(AβP1-42)对体外培养的大鼠神经干细胞的作用，我们作了如下实验：①分别将不同浓度的AβP1-42加入神经干细胞培养液中，培养24h、48、72h后分别收集细胞，台盼兰拒染法测定细胞数，结果显示，当AβP1-42在6μmol/L时对神经干细胞增殖就有抑制作用，在12.5μmol/L时