慢性病毒性肝炎是常见的严重危害人类健康的传染性疾病,全球60亿人口中,约20亿人曾感染乙型肝炎病毒(HBV),其中3.5~4亿人为慢性HBV感染者,约占全球人口的6%。慢性乙型肝炎患者或病毒携带者是发展为肝硬化和肝细胞癌的危险因素,15%~25%的感染者或携带者最终将死于与乙肝病毒感染相关的疾病。据WHO报告,全球每年约有100万人死于与乙肝病毒感染相关的肝病,占疾病死因的第九位,其中75%分布在亚太地区。我国是HBV感染的高流行区,病毒携带者约达1.3亿,HBV平均携带率为10%,部分地区如广东、湖北达到15%以上,其中慢性乙型肝炎现症患者约有3000万之众,且每年新增约200万。据一项疾病经济学调查表明,我国因慢性乙型肝炎及其相关疾病(肝硬化、肝癌等)每年造成的直接经济损失高达1122.8亿元人民币。病毒性肝炎、肝硬化不仅严重危害人民的健康,而且给国家带来了严重的社会经济负担。慢性乙型肝炎的发病机制较为复杂,涉及到病毒复制、炎症介质释放、免疫功能紊乱及自由基损伤等多个环节,其中病毒持续复制和机体免疫清除是慢性乙型肝炎发病的两个基本要素,而HBV在体内持续复制是其迁延难愈的主要原因。因此,国内外对慢性乙型肝炎的治疗也采取了抗病毒、免疫调节、抗炎、改善肝功能和抗肝纤维化等综合措施,其中抗病毒治疗是关键。目前,使用干扰素、拉米夫定等药物进行临床治疗,通过抗病毒和调节机体免疫功能等作用,可诱导疾病缓解,阻止肝硬化进程,防止出现肝衰竭和/或肝细胞癌等严重后果,取得了良好的临床效果,但也存在价格昂贵,停药后反跳和长期服用易出现点突变,产生耐药性等局限性,使乙肝病毒感染始终是困扰人们的巨大难题。因而,寻找新型、价廉、有效的治疗乙型肝炎的药物一直是人们不懈追求的目标。国内在应用中草药辩证施治或单方治疗慢性乙型肝炎方面已有长期的历史,其临床应用日趋广泛,而对其发挥药理作用的物质基础、作用机制、应用范围和疗效等方面的研究工作也在不断深入。琐琐葡萄(Vitis vinifera L.)为葡萄科(Vitaceae)葡萄属植物山葡萄,属无核红葡萄品系,木质藤本,主要分布在东亚,我国主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地,是医药文献如《神农本草经》、《本草纲目拾遗》、《维吾尔药志》等所记载的药用葡萄品种之一。其果实,味甜微酸、气微、无毒,可内服、煎汤、捣汁或浸酒,有补气血,强筋骨,利小便之功效,主治气血虚弱,肺虚咳嗽,心悸盗汗,风湿痹痛等,传统医学常用作补气药,有解表透疹、补五脏、退黄等功效;维吾尔医用于治疗脾胃不和、头晕腰酸、神志不安等,民间用于小儿麻疹、肝炎等症,具有良好的临床效果。但是,目前有关对琐琐葡萄系统的植物化学、药理作用及作用机制的研究报道较少。为了揭示维药琐琐葡萄抗病毒作用的物质基础及其可能的作用机制,为维吾尔医药用琐琐葡萄治疗肝炎等病毒性疾病提供科学依据,促进维吾尔医药的理论发展;同时,也为了充分利用新疆丰富的葡萄资源,变资源优势为经济优势,研制开发安全、有效、价廉的免疫调节制剂或抗病毒民族新药提供新思路,促进地区经济和社会的发展,本课题围绕维药琐琐葡萄的化学成分、抗病毒作用、免疫调节作用及其作用机制开展了系列研究。1、琐琐葡萄化学成分的研究目的:分析琐琐葡萄的化学成分,鉴定其结构,测定其含量,初步探讨琐琐葡萄多糖的还原能力及清除自由基能力。方法:采用乙醇提取,硅胶柱层析等方法分离琐琐葡萄脂溶性部位;采用聚酰胺等柱层析方法分离琐琐葡萄水溶性部位,采用1H-NMR、12C-NMR和MS等现代光谱技术进行结构鉴定;采用热水提取、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白等方法提取琐琐葡萄多糖(VTP),并采用苯酚-硫酸法测定其含量,比较不同浓度VTP(200、400、600、800、1000μg/ml)和抗坏血酸VC(50、100、200、400、600、800、1000μg/ml)的还原能力以及不同浓度VTP和VC(均为40、80、160、320、600、800μg/ml)清除DPPH·的能力。结果:从琐琐葡萄脂溶性部位中提取分离得到琐琐葡萄总三萜(VTT),并纯化得到齐墩果酸(OA,Ⅰ),采用HPLC测定OA在VTT中的平均含量为65.52%;从琐琐葡萄水溶性部位中提取分离得到琐琐葡萄总黄酮(VTF),并从中分离得到异槲皮苷(Ⅱ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸钠盐(Ⅲ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸乙酯苷(Ⅳ)、没食子酸(Ⅴ)、单咖啡酰酒石酸(Ⅵ)等五个化合物,化合物Ⅱ~Ⅵ为首次从该植物中分离得到,其中化合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为首次从该属植物中分离得到;建立了VTP的提取及纯化方法,采用苯酚-硫酸法测定琐琐葡萄中多糖的含量为8.19%,经体外试验研究结果显示VTP的还原能力及清除DPPH·的能力随其浓度的增加而增大,在800μg/mL时,DPPH·清除率达到90%以上,接近VC的清除率,提示VTP具有较好的抗氧化能力。结论:通过琐琐葡萄系统的植物化学研究及结构鉴定,结合本课题组前期研究结果证实,该植物在民间药用治疗疾病的物质基础至少包括三萜、黄酮和多糖三大类化合物,其中,琐琐葡萄多糖含量较高,并具有较好的抗氧化能力,显示出良好的市场开发前景。2、琐琐葡萄体外抑制HBV的实验研究目的:研究琐琐葡萄提取物VTT、VTP和VTF的体外抗HBV作用及其联合作用。方法:通过VTT、VTP和VTF作用于体外培养的Hep G 2.2.15细胞,观察和比较VTT、VTP和VTF对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV DNA的影响及药物的细胞毒性;采用正交试验设计,观察VTT、VTP和VTF对体外培养的Hep G 2.2.15细胞分泌HBeAg的影响。结果:VTT、VTP、VTF及三者共同作用于Hep G 2.2.15细胞8天后,对细胞的半数毒性浓度TC50分别为160.61、1412.85、284.91和244.77μg/ml;VTT、VTP、VTF对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg的半数有效浓度(IC50)依次为62.54、112.69、327.56μg/ml,其治疗指数(TI)依次为2.57、12.54和0.87;对HepG 2.2.15细胞分泌HBeAg的IC50依次为89.28、204.46、215.34μg/ml,其TI依次为1.80、6.91和1.32;而对HepG 2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用,则表现为随着VTT、VTP和VTF浓度的增大,抑制作用逐渐增强;正交实验设计结果显示,VTT、VTP和VTF抑制Hep G 2.2.15细胞分泌HBeAg具有显著的交互作用,抑制强度依次为A×B×C>B×C>B>C,药物最佳组合为A2B1C1,即VTT 25μg/ml、VTP 50μg/ml和VTF 50μg/ml共同干预时,对Hep G 2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制效果最佳。结论:通过体外抗病毒筛选研究初步证实,琐琐葡萄提取物VTT、VTP、VTF具有一定的体外抗HBV作用,其发挥抗病毒作用的物质至少包含VTT、VTP和VTF,这些活性部位既可单独作用也可联合作用发挥抗病毒效果。3、琐琐葡萄体内抗鸭乙肝病毒作用的研究目的:研究琐琐葡萄提取物抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用。方法:采用荧光定量PCR法筛选先天感染DHBV的雏鸭为动物模型,共30只,根据DHBV DNA含量进行分层,随机分为病毒对照组、阳性对照药物拉米夫定组、琐琐葡萄提取物低、中、高剂量组,共5组,每组6只。除病毒对照组给予生理盐水外,其余各组均按设定剂量灌胃给药,给药体积为0.8 ml/只,一天1次,连续10天,斑点杂交法观察用药前(T0)、用药后(T5、T10)及停药后(P5)血清中DHBV DNA表达的变化。结果:琐琐葡萄提取物中剂量组在用药第10天(T10),血清中DHBV DNA均较给药前(T0)明显下降,停药5 d后(P5)有反跳的趋势,但反跳强度不大;低、高剂量组在给药期间未表现出明显抑制DHBV DNA的作用。结论:琐琐葡萄提取物具有一定的抑制DHBV DNA作用,与体外抗病毒试验结果基本一致,显示出较好的临床应用前景。4、琐琐葡萄对大鼠原代肝细胞免疫损伤保护作用的研究目的:观察琐琐葡萄提取物VOA、VTT、VTP和VTF在体外对大鼠原代肝细胞免疫性损伤的保护作用,为整体动物实验研究筛选受试物。方法:SD雄性大鼠6只,随机分为正常组与模型组,模型组采用卡介苗(BCG)整体致敏,脂多糖(LPS)离体攻击法建立大鼠原代肝细胞免疫损伤模型;采用MTT法分别测定VOA、VTT、VTP、VTF及阳性对照药物肝立欣(Grz)和联苯双酯(DDB)的细胞毒型;活性筛选试验中,模型组肝细胞分别加入DMEM培养液配制的二甲基亚砜溶液(DMSO)200μg/ml,DDB溶液5、10、20μg/ml, Grz溶液5、10、20μg/ml及VOA、VTT、VTP或VTF溶液5、20、80μg/ml,测定并比较不同培养时间(3、6、12、24 h)各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和一氧化氮(NO)的含量。结果:细胞毒性试验结果显示,VOA、VTT、VTP、VTF、Grz和DDB的半数毒性浓度TC50分别为408.53、348.57、676.04、334.33、513.66和458.44μg/ml;细胞活性试验结果显示,正常大鼠肝细胞上清ALT、AST和NO基本未见改变,BCG+LPS损伤后大鼠肝细胞培养上清液中ALT、AST和NO在6、12和24 h较正常大鼠肝细胞明显升高(P<0.01),而从琐琐葡萄中提取的VOA、VTT、VTP或VTF(5,20,80μg/ml),在6、12和24 h均可不同程度地使升高的ALT、AST和NO明显下降(P<0.01),尤其是VTP和VTF的降酶效果呈现一定的剂量依赖关系,与阳性对照药物DDB和Grz作用相似。结论:琐琐葡萄提取物VOA、VTT、VTP和VTF在体外对大鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用。5、琐琐葡萄对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及作用机制研究目的:研究琐琐葡萄提取物VTT、VTP和VTF对小鼠免疫性肝损伤的保护作用,并对其作用机制进行初步探讨,为阐明维医药用琐琐葡萄治疗肝炎等病提供理论依据,也为充分利用新疆丰富的葡萄资源优势,开发出安全、价廉、有效的抗病毒免疫调节制剂或保肝民族新药提供实验依据。方法:昆明种雄性小鼠144只,随机分为正常对照组、免疫性肝损伤模型组(BCG+LPS组)、DDB阳性对照组(200 mg/kg)以及VTT、VTP和VTF低、中、高剂量组(50、150、300 mg/kg)共12组,测定并比较各组小鼠肝脏、脾脏系数,采用连续监测法或比色法测定并比较各组小鼠肝组织匀浆中ALT、AST和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)和NO的含量,采用流式细胞仪测定各组小鼠外周血中CD4+/CD8+细胞亚群的比例,采用酶链免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、白介素-2(IL-2)和白介素-4(IL-4)细胞因子的变化,采用免疫组化法观察细胞凋亡基因Bax和Bcl-2在小鼠肝组织中表达的变化,并采用HE染色,观察各组小鼠肝脏病理组织学变化。结果:(1)VTT、VTP和VTF均可不同程度地抵抗免疫性损伤所致小鼠肝脏和脾脏的肿大,有效恢复肝组织ALT和AST活性,升高免疫性肝损伤小鼠肝组织中SOD活性、减少MDA和NO的生成,尤其是VTF升高小鼠肝组织SOD活性具有显著的剂量依赖关系,而降低NO生成作用在各受试物中都显示一定的浓度依赖关系;(2)VTT、VTP和VTF未引起小鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量的变化,但各受试物的高剂量组均可不同程度的显著降低IFN-γ的分泌,促进IL-10的分泌,同时也呈现出降低IL-2分泌,促进IL-4分泌的趋势,且VTT和VTF各剂量组间促进IL-10的分泌呈现一定的剂量反应关系,VTT、VTP和VTF可在一定程度上调节Th1和Th2型细胞因子分泌,恢复Th1/Th2细胞的平衡;(3)VTT、VTP和VTF均能不同程度的抑制肝损伤小鼠肝组织中Bax的表达,并促进Bcl-2的表达,恢复凋亡基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2的表达平衡,且VTP各剂量组间对Bax和Bcl-2表达的调节均具有一定的剂量反应关系,而VTF各剂量组间对促进Bcl-2的表达具有一定的剂量反应关系;(4)小鼠肝脏病理组织学检查结果显示,VTT、VTP和VTF均可在一定程度上改善肝组织病理损伤,恢复肝脏功能,与生化检查结果相一致。结论:VTT、VTP和VTF对小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与提高机体抗氧化物酶活性,有效清除自由基,降低脂质过氧化产物生成,保护肝细胞膜的完整性,改善肝细胞功能,调节Th1和Th2型细胞因子分泌,恢复Th1/Th2细胞的平衡及调节细胞凋亡基因的表达等有关。综合琐琐葡萄植物化学分析、抗病毒作用、免疫调节作用及机制研究结果初步证实,琐琐葡萄发挥抗病毒作用和免疫调节作用的物质基础至少包含三萜、黄酮和多糖三大类化合物;而抑制HBV HBsAg、HBeAg分泌和HBV DNA合成及提高机体抗氧化物酶活性,有效清除自由基,降低脂质过氧化产物生成,保护肝细胞膜的完整性,改善肝细胞功能,调节机体免疫功能紊乱、抑制肝细胞过度凋亡的综合作用,可能是琐琐葡萄提取物VTT、VTP和VTF发挥抗病毒和免疫调节的药理学作用机制。这为阐明VTT、VTP和VTF与琐琐葡萄抗病毒、免疫调节作用的关系及其可能的作用机制提供了实验依据,也为维吾尔医药用琐琐葡萄治疗乙型肝炎等病毒性疾病提供了科学依据,将促进维吾尔医药的理论发展,为充分利用新疆丰富的葡萄资源,变资源优势为经济优势,进一步研制开发安全、有效、价廉的免疫调节制剂或抗病毒民族新药提供了新的思路,促进地区经济和社会的发展。