背景与目的：缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是临床工作中常见的围产期新生儿因缺氧缺血引起的脑损伤疾病，多可导致感音神经性聋(sensorineural deafness)。与HIE有关的研究已涉及到许多领域，近年来，一氧化氮(NO)在HIE中的作用日益引起人们的关注，有关研究逐渐增多。NO是一种内源性的气体神经递质，是细胞间信息交流的载体，具有双重作用。生理状况下，少量释放的NO传递信息，在人机体的正常功能调节中发挥着重要的作用。缺氧缺血时，NO则通过大量的释放，发挥着强大的细胞毒性作用。在体内，NO不易测定，因一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO合成的主要限速酶，故常以NOS的活性来间接反映NO的水平高低。当前，人们对内耳NO及NOS在正常生理情况下的研究已取得了相当大的进展，但在内耳病理生理条件下的研究，尤其在HIE患儿听觉系统和各种动物模型等方面的研究还刚刚起步，而有关NO、NOS在缺氧缺血新生大鼠耳蜗损伤中作用的研究，国内外更未见相关报道。为进一步探讨NO、NOS在HIE听力损伤发病机制中的作用，本课题结合不同时间点的听性脑干诱发电位(ABR)和耳蜗动作电位(AP)的测试，采用免疫组织化学技术，观察HIE时神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在其中的变化，探讨NO、NOS是否参与HIE导致的听力下降，以期为临床预防和治疗HIE导致的听力下降提供理论依据和实验基础，相信会有助于缺氧缺血时耳蜗损伤机制的研究，相信会对临床HIE的治疗有所启迪。 方法：郑州大学2001级硕士研究生毕业论文nNOS、iNOS在缺氧缺血新生大鼠耳蜗损伤中的作用 1.选用体重在9~209的健康新生7日龄Wistar大鼠60只，雌雄不拘，无耳毒性药物使用史，随机分为工组:正常对照组(12只);H组:假手术组(12只);111组:缺氧缺血6h组(12只);W组:缺氧缺血1 Zh组(12只);V组:缺氧缺血48h组，共计5组。 2.HIE模型采用经典Rice法，即分离并双线永久结扎大鼠的左侧颈总动脉，然后置于5%氧气(02)+95%氮气(NZ)(体积比)低氧密闭容器中，经病理证实有HIE表现者方可认为是成功的HIE动物模型。HIE动物模型是否成功须由脑组织HE染色病理证实。正常对照组不做任何处理。假手术组则只分离颈总动脉但不结扎，也不置于低氧容器。 3.各组动物分别于处死前测试听性脑干诱发电位(ABR)和动作电位 (AP)，记录ABR的闭值和I、11、m波潜伏期及11一m波间期。AP主要测量Nl波的阂值和潜伏期。ABR和AP刺激声为交替短声(click)，刺激强度从90dB开始，以10dB一档递减至11波消失为止。ABR和AP均以70dB刺激强度所得的各测量参量进行统计学分析。实验数据由SPSS10.O软件处理，采用单因素方差分析，所有数据用均数士标准差行士s)表示，以P<0.05为差异有显著性意义。 4.测试完毕后行心内灌注，然后立即取脑干、耳蜗组织，进行脑干、耳蜗标本HE染色病理观察，及耳蜗组织nNOS、iNOS免疫组化染色，对其采用HPIAS一1 000电子计算机图像分析系统分析，所得的灰度值由SPSS10.0软件处理，采用单因素方差分析，所有数据用均数土标准差扮士s)表示，以P<0 .05为差异有显著性意义。 结果: 1.正常对照组和假手术组相比ABR阂值和I、n、m波潜伏期、n一m波间期以及APN;波的阂值和潜伏期均无明显差异(P>0.05)。12h组及48h组与正常对照组相比ABR闺值显著升高，I、缺氧缺血6h组、n一111波间期显著延长(P<0.05)，AP Nl波的闭值显著升高，(P<0 .05)。、nl波潜伏期及潜伏期显著延长 2.脑组织HE染色观察，缺氧缺血6h组、12h组及48h组可见神经元水肿，而且数目减少，尼氏体减少，而正常对照组无此改变。 3.耳蜗组织HE染色观察，正常对照组耳蜗的外毛细胞排列整齐，缺氧缺郑州大学2001级硕士研究生毕业论文nNOS、iNOS在缺氧缺血新生大鼠耳蜗损伤中的作用血6h组外毛细胞明显倒伏、变形，12h组及48h组外毛细胞损伤加重，血管纹萎缩变薄，而内毛细胞和盖膜未见明显变化。 4.免疫组化结果显示正常对照组和假手术组耳蜗的内、外毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹组织均有nNOS弱阳性表达，呈棕黄色，颗粒状，胞浆着色，图象分析系统显示灰度值无显著性差异(P>0.05)。而缺氧缺血 6h组、12h组及48h组与正常对照组相比灰度值小，即有明显差异(P<0.05)，其中缺氧缺血6h时，灰度值最小(P<0.05)。正常对照组和假手术组耳蜗的内、外毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹组织均无iNOS阳性表达，而缺氧缺血6h组、12h组及48h组与正常对照组相比灰度值小，即有明显差异(P<0.05)，其中缺氧缺血48组的灰度值最小(P<0.05)。nNOS和iNOS的免疫组化阴性对照均不着色。 结论: 1.缺氧缺血时，nNOS和iNOS在新生大鼠耳蜗的内、外毛细胞，血管纹，螺旋神经节等细胞的分布增多，但两者的活性变化不同，分别在缺氧缺血的早期和晚期时活性最强。 2.缺氧缺血时，nNOS和iNOS在耳蜗组织分布的变化与耳蜗组织的损伤程度呈正相关。 3，本实验研究推测，nNOS和iNOS通过耳蜗微循环、毛细胞的代谢、神经递质等多种途径，参