C2C12细胞成肌分化基因芯片统合分析及Lrrc75b对成肌分化的作用

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[目的]:  1.对C2C12细胞成肌分化芯片进行统合分析,筛选出C2C12细胞成肌分化一致性差异表达基因集,并采用生物信息学软件分析成肌分化相关基因本体和信号转导通路。  2.探讨差异表达基因Lrrc75b对C2C12细胞成肌分化的影响及作用机制。  [方法]:  1.采用dChip软件对GEO数据库中C2C12成肌分化芯片GSE4694、GSE5447、GSE5305进行分析。采用GATHER软件对一致性上调(或下调)基因集进行基因本体、KEGG Pathway富集分析。  2.用2%马血清对C2C12细胞进行成肌分化诱导,显微镜下观察成肌分化0d,1d,3d,5d的细胞形态变化及肌管形成;收集成肌分化0d,1d,3d,5d蛋白质,Western印迹实验检测成肌标志蛋白myogenin,MyHC的表达情况。  3.用2%马血清对C2C12细胞进行成肌分化诱导,提取成肌分化0d,1d,3d,5d细胞RNA,qRT-PCR检测Lrrc75b在成肌分化过程的时序表达模式。  4.Lrrc75b stealth RNAi转染C2C12细胞,进行成肌分化诱导,于第3d进行免疫荧光染色,观察肌管形成情况;Western印迹实验检测成肌分化0h,12h,24 h,48 h,72 h myogenin,MyHC蛋白表达情况及成肌分化0h,24 h,48h,72 h ERK1/2蛋白的表达变化。  5.Lrrc75b重组腺病毒感染C2C12细胞,进行成肌分化诱导,于第5d进行免疫荧光染色,观察肌管形成情况;Western印迹实验检测成肌分化0d,1d,3d,5 d myogenin,MyHC蛋白表达情况及ERK1/2蛋白的表达变化。  [结果]:  1.通过对C2C12成肌分化基因芯片进行分析,筛选出GSE4694中上调表达基因1497个,下调表达基因1539个;GSE5447中上调表达基因2378个,下调表达基因2439个;GSE5305中上调表达基因1177个,下调表达基因2101个。对上述结果进行统合分析,在2个及以上实验数据中均出现差异表达的一致性上调表达基因集932个,一致性下调表达基因集1198个。GATHER软件分析表明:一致性上调表达基因集中富集GO:0006936(muscle contraction),GO:0007517(muscle development)等基因本体;mmu04910(Insulin signalling pathway),mmu04020(Calcium signalling pathway), mmu04010(MAPK signaling pathway)等信号通路。而一致性下调表达基因集中主要富集GO:0007049(cell cycle),GO:0008283(cell proliferation)等基因本体;mmu00240(Pyrimidine metabolism),mmu00230(Purine metabolism)等代谢相关信号通路。  2.C2C12细胞形态呈梭形,均一;当细胞处于成肌分化诱导液培养,2d后细胞开始融合,出现两个核以上的肌管,随着成肌诱导时间的延长,肌管数量逐渐增加,肌细胞逐渐融合,肌管逐渐变大变长。Western印迹实验结果显示成肌分化过程成肌分化标志蛋白myogenin,MyHC表达逐渐增加。  3.基因芯片分析结果提示Lrrc75b在成肌分化中表达下调。在C2C12成肌分化模型,qRT-PCR结果进一步证明,成肌分化过程Lrrc75b mRNA表达水平逐渐降低。  4.免疫荧光染色结果显示,与si-Control组比较,si-Lrrc75b组肌管面积、肌管融合指数明显增加,两组差异具有统计学意义(P<0.05);与Ad-GFP组比较,过表达Ad-Lrrc75b组肌管面积、肌管融合指数明显减少,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。  5.与si-Control组比较,sj-Lrrc75b组成肌标志蛋白myogenin,MyHC的表达量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与Ad-GFP组比较,过表达Ad-Lrrc75b组myogenin蛋白表达量明显减少,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。  6.与si-Control组比较,si-Lrrc75b组抑制ERK1/2磷酸化水平;与Ad-GFP组比较,过表达Ad-Lrrc75b组上调ERK1/2磷酸化水平。  [结论]:  1.成肌分化芯片Meta分析结果显示,一致性上调表达基因集932个,一致性下调表达基因集1198个,其中Lrrc75b是一致性下调表达基因。  2.在C2C12细胞成肌分化模型,伴随成肌分化的发生,Lrrc75b mRNA表达水平逐渐降低,与基因芯片Meta分析结果相符合。  3.在C2C12成肌分化过程,通过RNAi方法特异性降低Lrrc75b基因表达,肌管面积、肌管融合指数明显增加;myogenin,MyHC蛋白表达量明显增加。结果表明下调Lrrc75b表达,促进C2C12细胞成肌分化。  4.通过重组腺病毒高表达外源性Lrrc75b基因,C2C12细胞成肌分化能力下降,肌管面积、肌管融合指数明显减少,myogenin蛋白表达量明显减少。结果表明过表达Lrrc75b,抑制C2C12细胞成肌分化。  5.与si-Control组比较,si-Lrrc75b组抑制ERK1/2磷酸化水平;与Ad-GFP组比较,过表达Ad-Lrrc75b组上调ERK1/2磷酸化水平。提示Lrrc75b对成肌分化的调节作用可能通过ERK1/2通路实现。
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