论文部分内容阅读
研究背景和目的：精子发生是一个精巧而复杂的过程,哺乳动物的精子发生主要分为3个阶段：精原细胞的自我更新和分化,精母细胞减数分裂以及精子形成。精子发生受多种因素的精细调节以确保把正确的基因和表观遗传信息传给子代,包括激素、蛋白因子以及miRNAs的调节。在生精小管中生精细胞凋亡是生精细胞固有的特征,研究发现在小鼠的睾丸中有2次凋亡高峰期,即原始生殖细胞迁移到生殖腺嵴和开始第一波精子发生的时候。并且在正常的精子发生过程中一半以上的生精细胞发生凋亡。在正常精子发生中,生精细胞凋亡发挥着重要的作用,它能够维持生精细胞的数量,去除有缺陷的生精细胞。但是异常的凋亡将影响精子发生,引起生育障碍。SET基因是原癌基因,可产生两种蛋白：模板活化因子-1a (TAF-1a)和SET/TAF-1β,两者氨基端的氨基酸不同,而SET/TAF-1β亚型发挥SET蛋白的主要生物学作用。SET蛋白的功能极为丰富,包括细胞周期、细胞增殖凋亡、DNA修复、基因转录以及表观遗传等多个生物过程。研究还发现SET表达于卵巢卵泡膜细胞和卵母细胞,参与卵巢雄激素的生成和卵母细胞的发育。本课题组前期研究发现,SET蛋白主要表达于生精小管中的精原细胞和精母细胞以及睾丸间质细胞,在支持细胞中也有低表达,提示SET蛋白调节精子发生以及睾丸间质细胞雄激素的生成。综上, SET蛋白作为睾丸内局部表达的因子,可能参与调节精子发生。为验证上述假说,本研究以精原细胞株和精母细胞株为模型,干涉细胞中的SET蛋白表达,研究SET蛋白对精原细胞和精母细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。材料与方法：(1) 含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液在37℃、5%C02条件下培养小鼠精原细胞GC-1 spg和精母细胞GC-2spd。实验分2组：对照组转染无关序列腺病毒(AdH1-siRNA/NS);实验组转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET).(2) 免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1 spg和GC-2 spd细胞中的表达与定位。(3) AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET感染GC-1 spg和GC-2 spd细胞48h,蛋白印迹(Western Blot)方法检测转染前后SET蛋白的表达,验证SET干涉腺病毒的效率。(4) GC-1 spg和GC-2 spd细胞转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测细胞活率。(5) 体外培养GC-1 spg和GC-2 spd细胞,转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,5一溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞增殖情况。(6) GC-1 spg和GC-2 spd细胞转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,流式细胞仪检测细胞周期的变化；(7) GC-1 spg和GC-2 spd细胞转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后72h,流式细胞仪检测细胞凋亡。(8) GC-1 spg和GC-2 spd细胞转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h和72h,提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞增殖和凋亡的相关因子AKT、p-AKT (T308)、p-AKT (S473)、caspase3、cleaved-caspase3、Bax、Bcl2、 caspase9、cleaved-caspase9、caspase8、cleaved-caspase8的变化。(9) 统计学方法：采用SPSS2统计学20.0统计软件进行数据处理与分析,采用独立样本t检验比较两组间差异,以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05为差异具有统计学意义。结果：(1) SET蛋白表达于GC-1 spg和GC-2 spd细胞的胞核和胞浆中,且胞浆多于胞核。(2) GC-1 spg和GC-2 spd细胞转染AdH1-siRNA/NS和AdH1-siRNA/SET后48h,在对照组相对,GC-1 spg细胞和GC-2 spd细胞干涉组SET蛋白分别降低了55%(**P<0.01)和50%(*P<0.05),表明SET干涉腺病毒是有效的。(3) 降低SET蛋白表达后,与对照组相比,GC-1 spg和GC-2 spd细胞活率,分别减少了80%(**P<0.01)%和50%(**P<0.01)。(4) 降低SET蛋白表达后,与对照组相比,GC-1 spg和GC-2 spd细胞增殖分别减少了11%(*P<0.05)和15%(**P<0.01)。(5) 降低SET蛋白表达后,与对照组相比,GC-1 spgd的S期减少了7%(**P<0.01),G2/M期增加了40%(**P<0.01); GC-2 spd的S期减少了18%(*P<0.05),G0/G1期增加了11%(**P<0.01),G2/M期增加了65%(*P<0.05)。(6) 降低SET蛋白表达后,与对照组相比,GC-1 spg和GC-2 spd细胞凋亡率分别增加了1.5倍(**P<0.01)和5倍(**P<0.01)。(7) 降低SET蛋白表达后,与对照组相比,GC-1 spg细胞和GC-2 spd细胞干涉组cleaved-caspase3分别增加了2.3倍(*P<0.05)和1.6倍(*P<0.05),Bcl2/Bax分别减少了60%(*P<0.05)和50%(**P<0.01),cleaved-caspase9分别增加了40%(*P<0.05)和33%(**P<0.01),cleaved-caspase8分别增加了2.2倍(*P<0.05)和1-8倍(*P<0.05), p-AKT (S473)/AKT分别减少了25%(*P<0.05)和40%(**P<0.01)。结论。(1) 降低小鼠精原细胞中的SET蛋白表达,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。其机制是SET蛋白特异性抑制AKT (S473)磷酸化,下调AKT信号通路,激活内源性和外源性凋亡信号通路。(2) 降低小鼠精母细胞中的SET蛋白表达,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。其机制也是通过特异性抑制AKT (S473)磷酸化,下调AKT信号通路,激活内源性和外源性凋亡信号通路。(3) 这些结果提示SET蛋白是调节精原细胞和精母细胞增殖和凋亡的重要因子,是调节精子发生的重要局部调节因子。(4) 本研究证明SET蛋白是调节生精细胞增殖和凋亡的重要局部调节因子,深入研究SET蛋白在精子发生中的作用有利于我们进一步理解男性少弱畸精子症的发生机制,对于临床男性不育症的治疗具有重要意义。