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背景 胰腺癌具有早期浸润、转移的特点，五年生存率仍较低。大部分患者在确诊时癌肿已转移或侵袭到胰外器官而无法行根治切除，而放、化疗对提高这些患者的2年生存率作用不大。手术仍是治疗的关键手段，而术后放、化疗对提高生存率作用亦很有限。因此，寻求新的有效的治疗手段是基础研究者和临床医生共同努力的方向。随着肿瘤免疫学和分子生物学研究的进展, 胰腺癌的发生、发展和转移机理的分子机制已部份阐明。为基因治疗胰腺癌提供了理论基础。其中，免疫治疗是胰腺癌治疗一条新的途径，但目前免疫治疗总的效果仍不确切，许多还处于临床前实验阶段，加上人体免疫机制十分复杂，有些环节到目前为止还不清楚，需要继续深入地研究，以便更好地发挥免疫治疗的作用。白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)在免疫调节中有重要作用，为了解它们对胰腺癌细胞PC-3的影响，我们在小鼠体内外进行了研究。第一部分 IL-18和GM-CSF基因转染PC-3胰腺癌细胞株目的： 制备IL-18和GM-CSF基因转染胰腺癌细胞株PC-3（pancreatic carcinoma strain 3）。方法： 通过脂质体转染法，将含IL-18和GM-CSF基因的质粒及空质粒转染至PC-3细胞。IL-18和GM-CSF基因的表达由蛋白质免疫印迹法(Western blot)鉴定。酶联免疫吸附法（ELISA）法检测培养液中IL-18和GM-CSF活性。结果： 转染细胞的蛋白提取物经Western blot检测见在相应位置出现特异性条带，显示有相应蛋白表达。ELISA法检测6×104/ml组和3×104/ml组转染pCDNA3.1-GM-CSF 后PC-3细胞24小时的培养液，发现GM-CSF浓度分别为35.28±2.52 pg/ml和17.35±2.41 pg/ml；6×104/ml组和3×104/ml组转染pCDNA3.1IL-18后24小时培养液，发现IL-18浓度分别为534.88±54.83 pg/ml和170.50±48.26 pg/ml。结论： 证实脂质体转染IL-18和GM-CSF基因获得成功，PC-3细胞存在表达且基本符合量效关系，可以用作进一步研究。<WP=5>第二部份 IL-18和GM-CSF转染PC-3细胞后对 小鼠免疫细胞的体外效应研究目的：研究巨噬细胞和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）对转染 IL-18和 GM-CSF基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用。 方法： 肿瘤细胞PC-3用Calcein AM 荧光标记。巨噬细胞由小鼠腹腔注射刀豆蛋白A（Con A）刺激后分离并培养。杀伤实验按效靶比10：1或20：1各分五组，为空白对照组、空质粒组、GM-CSF组、IL-18组和混合组。其中混合组为转染pCDNA3.1-IL-18质粒与pCDNA3.1-GM-CSF质粒的等量混合PC-3细胞。48小时后ELISA法检测IL-18组和空质粒组上清液中的GM-CSF浓度；测GM-CSF组、空质粒组和上清液中的IL-18浓度；检测效靶比10：1各组上清液中的TNF-α浓度。裸鼠PBMC用Ficoll液分离，按效靶比10：1或20：1设IL-18 组、空质粒组和对照组。48小时后ELISA法检测效靶比10：1各组上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α) 的浓度。结果：在巨噬细胞对PC-3细胞杀伤试验的研究中，我们发现GM-CSF组、IL-18组和混合组的杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较有极显著意义，P< 0.001。用ELISA法检测48小时GM-CSF组、空质粒组、上清液中的IL-18浓度发现， GM-CSF组与空质粒组比较差异有极显著意义，P< 0.001。效靶比20:1组和效靶比10:1组比较差异有显著意义，P< 0.01。说明GM-CSF有促进IL-18的作用，且随浓度增加而增强。PBMC杀伤试验中IL-18组的杀伤率与空质粒组和空白对照组相比较差异有极显著意义。巨噬细胞和PBMC在对IL-18基因修饰的PC-3细胞杀伤过程可产生TNF-α，与对照组相比具有显著性差异。在效靶比为20:1时，PBMC和巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用远高于效靶比为10:1组。结论：IL-18和GM-CSF能增强巨噬细胞和PBMC杀伤PC-3细胞的能力，并存在量效关系。提示IL-18和GM-CSF基因用于胰腺癌的免疫治疗有潜在价值。第三部份 IL-18和GM-CSF基因对裸鼠皮下肿瘤模型的影响目的：通过裸鼠胰腺癌皮下肿瘤模型的研究，来分析IL-18和GM-CSF对肿瘤的影响以及联合使用后肿瘤在生长、凋亡方面的改变，从而来评价两种细胞因子基因的作用。方法：胰腺癌细胞PC-3消化制成细胞悬液，分空质粒组、GM-CSF组、IL-18组混合组混匀至0.2 ml，分别接种于裸鼠背部皮下，每组8只。接种2周后眶内采血，ELISA法测血清TNF-α。5周后处死小鼠时比较体重，切取皮下肿瘤，记录成瘤率，称重、计算肿瘤体积。流式细胞仪分析细胞周期变化。显微镜下观察移植瘤组织学检<WP=6>查情况。TUNEL检测肿瘤的凋亡情况。结果：接种PC-3细胞两周后小鼠血清TNF-α浓度检测发现，GM-CSF组和联合组与空质粒组比较有非常显著差异（P< 0.01）。IL-18组与空质粒组比较，有显著差异（P< 0.05）。接种前4组小鼠体重无显著差异（P> 0.05）。5周后处死小鼠时测量体重，发现联合组和IL-18组与空质粒组比较有非常显著差异（P< 0.01）；GM-CSF组与空质粒组比较有显著差异（P< 0.05）。成瘤率情况比较发现，空质粒对照组小鼠为100％；IL-18组为75%