研究目的已知癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用,发现新的癌基因或抑癌基因对肿瘤的诊断或治疗有潜在的价值。TIPE (tumor necrosis factor-α-induced protein8, TNFAIP8)家族是近几年新发现的与肿瘤相关的一组基因,由TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3组成,它们具有高度同源性,均包含有7个保守的α螺旋(α0-α6)结构,已有研究结果提示TIPE、TIPE1和TIPE2在多种肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因样作用,但作为TIPE家族的新成员--TIPE3的特性和在肿瘤中的作用尚未见报道。为了研究TIPE3的表达特点和在肿瘤中的可能作用,本课题制备了人TIPE3的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定；然后通过免疫组化的方法,利用所制备的抗体及正常组织芯片和常见肿瘤芯片,分析了TIPE3在人正常组织、肿瘤组织的表达谱；并对TIPE3表达有明显差异的两种肿瘤-非小细胞肺癌和食道癌进行重点研究,分析了TIPE3在癌和癌旁表达的差异及与临床病理参数的关系；最后,在体外,利用所构建的长、短及截断三种人TIPE3表达载体检测其对肿瘤细胞恶性行为(细胞增殖、细胞周期和细胞迁移)的影响,初步结果提示TIPE3具有癌基因样的作用。实验方法：1.标本：①人正常组织芯片：含有肝、肺、肾等18种个人正常组织；②多种肿瘤芯片：含有肺癌、食道癌和肝癌等10种肿瘤组织和相应的癌旁组织,每种3例；③非小细胞肺癌及癌旁组织芯片(58例)④食道癌及其癌旁组织芯片(29例)。2.人TIPE3真核表达载体的构建：以人TIPE3基因的克隆载体(pFL-B02cl)为模板,设计不同引物通过PCR得到相应目的片段并将其插入到pflag-cmv-2载体中,分别得到长(long-TIPE3)、短(short-TIPE3)和N末端截断(truncated-TIPE3) TIPE3重组载体。3. TIPE3多克隆抗体的制备：设计并合成抗原表位,与载体和佐剂混合后,多次免疫家兔制备兔抗人TIPE3多克隆抗体。4. Western Blot检测：裂解细胞后收取蛋白,SDS-PAGE电泳,PVDF膜印迹,TIPE2、TIPE3一抗孵育后,ECL显色检测蛋白表达。5、免疫组织化学：所制备兔抗人TIPE3多克隆抗体作为一抗,辣根酶标记羊抗兔二抗孵育,DAB显色检测芯片组织中TIPE3蛋白的表达情况。6、细胞活力检测(CCK8法)：将TIPE3载体转染进肿瘤细胞后,分别于0h、24h、48h和72h通过检测细胞线粒体中脱氢酶的甲瓒还原记录细胞活力。7.流式细胞术：细胞用胰酶消化成单个细胞后,加入PI染色后,流式细胞仪分析细胞周期。8、细胞迁移检测(Transwell法)：将空载体或三种TIPE3重组载体转染肿瘤细胞24h后,制备单细胞悬液,置transwell上层,检测细胞从上层向下层的迁移能力。9、统计学方法：应用非参数秩和检验(Wilcoxon检验)、卡方检验等分别对结果进行统计。结果：一.构建了含人TIPE3两个异构体(长和短)及N-末端截断的真核表达载体人TIPE3有两个异构体-长(292aa)、短(204aa),短型N末端有一个与TIPE2不同的结构域(这里简称N端结构域),我们分别构建了三种表达载体,即长TIPE3载体(long-TIPE3)、短TIPE3载体(short-TIPE3)和N端结构域被截断的TIPE3载体(truncated-TIPE3)并通过酶切电泳验证载体构建成功。二、TIPE3多克隆抗体制备及其特异性鉴定1、制备了兔抗人TIPE3的多克隆抗体：设计并合成TIPE3特异性抗原表位,与载体结合后,多次免疫兔制备兔抗人TIPE3特异性抗体,抗体滴度1：400。2. TIPE3抗体的特异性分析：为明确所制备抗体的可行性及特异性,我们将人TIPE2、TIPE3载体分别转染进入293细胞,分别用TIPE2、TIPE3抗体进行Western Blot检测。结果显示在用TIPE2抗体染色时,只在转染TIPE2组可见TIPE2的表达带,转染TIPE3及对照组均未显示有TIPE2条带；而用TIPE3抗体染色时,只在TIPE3组出现一明显的条带,分子量与预测的基本一致,转染TIPE2及对照组均未见相同大小条带,说明该条带即为人TIPE3蛋白的特异性条带,所制备的TIPE3抗体与TIPE2无交叉反应,特异性较高。三、TIPE3在人正常组织中的表达谱(一)表达部位TIPE3主要分布在细胞膜和细胞浆,胞核未见有TIPE3的阳性表达。(二)表达特点1. TIPE3在被覆上皮中的表达情况：由芯片结果可见,在单层扁平细胞,如肺泡上皮中,未见TIPE3表达；但在具有分泌功能的胰腺、汗腺和前列腺等导管单层立方上皮细胞中呈现TIPE3的明显高表达,肾小管和胆管上皮细胞中也明显高表达,但甲状腺单层滤泡上皮细胞、卵巢及肾上腺细胞中却未见其表达；在单层柱状上皮中,胃、小肠、大肠等黏膜上皮细胞中可见有TIPE3蛋白明显高表达。2. TIPE3在实质器官中的表达情况：在肝细胞中可见TIPE3低表达,而在肌组织(骨骼肌和心肌)及脑组织(大脑和小脑)细胞中却呈现广泛的高表达状态。四、TIPE3在人肿瘤中的表达特点及其临床意义一、TIPE3在肿瘤中的表达谱-芯片TIPE3在肿瘤中的表达谱：为了分析TIPE3与肿瘤的可能关系,我们采用免疫组化的方法,分析了TIPE3在组织芯片上的10种肿瘤的中的表达,结果发现TIPE3某些肿瘤组织中的表达高于其癌旁组织,提示其与肿瘤的生长代谢密切相关。二、TIPE3在食道癌中的表达和临床意义(一)TIPE3在癌旁和癌中表达的差别TIPE3蛋白在食管癌癌组织中的表达高于相应癌旁组织,差异有统计学意义(p<0.0001]。(二)TIPE3在食管癌中的表达与临床病例资料的相关性分析将肿瘤芯片中食管癌患者的临床病理资料进行分类整理,发现随着食管癌患者肿瘤组织病理分级的增加,TIPE3表达程度也相对增加。三、TIPE3在非小细胞肺癌中的表达和临床意义(一)TIPE3在癌旁和癌中表达的差别TIPE3蛋白在非小细胞肺癌癌组织中的表达高于其癌旁组织,差异有统计学意义(p<0.0001]。(二)TIPE3在非小细胞肺癌组织中表达强度与临床病例资料相关性分析我们将芯片中患者的病理资料分别进行分类,TIPE3在肺癌组织中表达的强度与患者年龄、性别和TNM分期均未发现有明显的相关性。(三)TIPE3膜型、浆型表达及其与临床病例资料的相关性分析根据TIPE3蛋白在肺癌组织中表达部位的不同,将TIPE3表达分为浆型和膜型两种类型,统计分析发现膜型TIPE3表达在T2-T3期患者中所占比例高于T1期患者。第四部分TIPE3对肿瘤细胞恶性行为的影响一、三组TIPE3质粒在肿瘤细胞(HepG2)中转染效率的检测为了后续研究TIPE3对肿瘤细胞恶性行为的影响,我们首先将三组TIPE3质粒转染进入肿瘤细胞,收取细胞蛋白后检测相应TIPE3蛋白的表达情况,结果显示三组过表达TIPE3质粒细胞都检测到相应TIPE3蛋白的表达,即质粒转染效率较高。二、TIPE3对肿瘤细胞增殖的影响为研究TIPE3对肿瘤细胞生长的影响,我们用长、短和截断的TIPE3重组表达载体分别转染肿瘤细胞系,于转染后Oh、24h、48h及72h用CCK8方法检测细胞活力。结果发现长型TIPE3对肿瘤细胞的生长无明显影响,但短型TIPE3明显促进肿瘤细胞的增殖,N端截断后不仅其促细胞增殖的作用消失,反而出现抑制效应,提示短型TIPE3可能在肿瘤中更重要,且N端功能域起关键作用。三、TIPE3对细胞周期的影响为研究TIPE3对肿瘤细胞周期的影响,我们将细胞种板,转染48小时后通过PI染色检测不同转染组细胞周期的改变。结果发现转染空载体组和TIPE3载体组细胞相比,细胞周期未见有明显改变。四、TIPE3对细胞迁移的影响为研究TIPE3对肿瘤细胞迁移能力的影响,我们用长、短和截断TIPE3重组表达载体分别转染肿瘤细胞系,转染24小时后,将细胞转移到transwell小室,分析细胞迁移能力。结果发现结果长型TIPE3对细胞的迁移能力没有明显的影响,但短型TIPE3明显促进肿瘤细胞的迁移,N端截断后其促细胞迁移的作用消失。说明短型TIPE3具有促进肿瘤细胞迁移的作用,且N端功能域起关键作用。结论1、成功制备了兔抗人TIPE3的特异性多克隆抗体,其与人同家族TIPE2蛋白之间没有交叉反应。2、人TIPE3在正常组织中有较广泛的分布,主要高表达于立方上皮和柱状上皮细胞、肌细胞及脑细胞中；在肿瘤组织中的表达因组织类型的不同而有所差异；在非小细胞肺癌及食道癌癌组织中的表达明显高于其相应癌旁组织,提示在这两种肿瘤中发挥更重要的作用。3、短型人TIPE3具有癌基因样作用,它的过表达可明显促进肿瘤细胞的增殖和迁移能力,其N端结构域对其功能是必须的。长型TIPE3作用不明显。创新性及意义1、首次制备了特异性抗体,明确TIPE3分别在人多种正常组织及肿瘤组织(特别是在肺癌和食道癌)中的表达特点,为TIPE3的功能研究奠定了基础。2、通过临床标本和体外实验初步确定短型人TIPE3具有癌基因样作用,其N端功能域是其功能所必须的,而长型作用不明显,以上为研究TIPE3在肿瘤中的作用和机制提供了线索。