糖尿病是临床的常见病、多发病，随着我国经济水平和人民生活水平的不断提高，糖尿病的发病率越来越呈现出升高的趋势，而糖尿病慢性创面不愈的问题则愈发突出。降低糖尿病慢性创面的发病率、促进创面愈合和减少截肢率不但能提高糖尿病患者的生活质量，而且能为降低社会医疗负担提供重大的现实意义。慢性创面不愈是糖尿病主要的并发症之一，每年用于治疗糖尿病足及其它慢性创面的费用，仅美国一年就高达150亿美元。难愈性创面是引起截肢的最主要原因，84﹪的糖尿病患者是因为糖尿病慢性创面引发截肢的。通常认为组织循环障碍和血管再生异常是糖尿病皮肤创面形成并且愈合延迟的主要原因，临床实践证明改善微循环有利于促进糖尿病患者创面的修复。另外感觉神经功能异常也是阻碍糖尿病创面愈合的重要原因，然而具体发病机制却不完全明了。目前糖尿病创面的治疗主要集中在清创、降低创面压力、防治感染和创面湿润环境的维持上面。但是这种治疗方法对局部组织有可能造成进一步的损伤，而且对糖尿病创面所致的截肢率并没有明显的降低。 目前有学者用骨髓间充质干细胞和其它一些成体干细胞应用于糖尿病慢性创面的修复研究当中。本课题组从2000年开始系统研究组织工程皮肤的构建，成功地分离、培养出人皮肤源祖细胞，研制出血浆真皮再生模板，并初步完成人皮肤源祖细胞复合血浆真皮再生模板构建组织工程皮肽的工作。在此基础上，本次课题通过将构建的皮肤源祖细胞一透明质酸复合物应用于糖尿病大鼠创面治疗，以观察皮肤源祖细胞对糖尿病创面血管和神经再生的情况。第一部分皮肤源祖细胞的培养、鉴定和体外诱导目的探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成脂、成骨的方法，为组织工程骨和组织工程皮肤构建提供理想的种子细胞。方法取出生1～3d的SD大鼠幼鼠皮肤，以含表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的培养液进行培养。观察细胞生长情况，描绘生长曲线；免疫荧光鉴定细胞表达Nestin和Fibronectin情况；取第3代细胞，分别用成脂和成骨诱导液培养14d，以油红0染色、茜素红染色和免疫荧光检测皮肤源祖细胞诱导成脂、成骨情况。结果细胞呈悬浮生长，迅速增殖形成克隆球团；细胞免疫荧光表达Nestin和Fibronectin；成脂诱导14d后，细胞内大量致密颗粒形成，油红0染色可见红色脂滴；成骨诱导14d后，茜素红染色可见暗红色钙盐沉积，骨桥蛋白表达阳性显示成骨细胞形成。结论皮肤源祖细胞具有干细胞的特性，能分化为成骨细胞和脂肪细胞，可作为组织工程骨和组织工程皮肤的种子细胞。 第二部分皮肤源祖细胞与透明质酸体外组织相容性的研究目的探讨透明质酸凝胶作为皮肤源祖细胞载体的可行性。方法将含第3代皮肤源祖细胞2.0×10<'4>个的悬液0.5ml加入到0.5ml的透明质酸凝胶中，通过倒置显微镜观察细胞形态，载体的亲水性及对细胞的粘附力；收集与透明质酸共培养的皮肤源祖细胞，描绘生长曲线，观察细胞在含10﹪血清的培养基中分化的情况；利用流式细胞仪检查比较共培养细胞与第3代皮肤源祖细胞的抗原表达、细胞周期和细胞活力，并对数据进行统计分析。结果皮肤源祖细胞在透明质酸凝胶中呈均匀散在分布；在载体中皮肤源祖细胞保持低倍增状态，并保持分化为神经元、神经胶质细胞及脂肪细胞的潜能；共培养细胞同时表达Nestin和Fibrotlectin的细胞为(88.58±2.99)﹪，细胞活力检测为(93.40±1.13)﹪，与对照组基本相似；共培养后细胞周期G<,0>／G<,1>细胞为(91.65±1.08)﹪，明显高于对照组。结论透明质酸与皮肽源祖细胞具有较好的组织相容性，对于皮肤源祖细胞的增殖及多分化潜能的维持，有利于透明质酸成为皮肤源祖细胞的载体界面，并为皮肤源祖细胞应用于创面移植创造了条件。第三部分皮肤源祖细胞一透明质酸复合物对糖尿病创面愈合的影响目的探讨皮肤源祖细胞(SKPs)一透明质酸(HA)复合物的构建，观察SKPs-HA复合物对糖尿病(DM)皮肤创面愈合的影响。方法分离培养SD大鼠SKPs，CM-DiI标记后以HA为载体构建复合物；60只SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导成DM模型，背部制作全层皮肤缺损创面，随机分为SKPs-HA复合物处理组(A组)、HA处理组(B组)和DMEM/F12培养基组作为空白对照(C组)，各组大鼠于治疗后1w、2w、3w和4 w留取创面组织标本，对创面愈合率、组织形态学改变、创面组织羟脯氨酸(HYP)含量、血管和神经再生进行检测，并观察SKPs在创面愈合过程中的迁移情况，生物力学检测愈合皮肤的弹性和韧性。结果A组和B组较c组更早出现创面上皮爬行，炎症反应较轻；A、B组愈合速度、愈合后表皮层厚度均高于C组，胶原排列更加规则有序；3w时，A组愈合率为(90.06±2.50)﹪，B组愈合率为(76.05±4.26)﹪，C组愈合率为(63.42±3.27)﹪，4w时A、B组完全愈合，C组愈合率为(94.20±1.36)﹪，差异有统计学意义(P<0.05)；A组HYP含量2w为(18.74±0.30)μg/mg，3w为(17.72±0.64)μg/mg，4w为(16.38±0.52)μg/mg，均高于C组；A组2w、4w血管密度分别为(39.65±3.56)个/mm<'2>和(58.46±7.49)个/mm<'2>，高于其他2组；神经再生主要发生于真皮层，表皮层较少，再生神经密度依次为：A组>B组>C组；SKPs在创面存活并随时间向真皮层迁移；生物力学检测：在相同外力作用下，皮肤长度变化依次为对照组<透明质酸组<皮肤源祖细胞一透明质酸组，最大断裂力SKPs-HA组为(2.673±0.024)N，HA组为(1.745±0.027)N，对照组为(1.291±0.537)N，结果各组间差异具有统计学意义。结论 SKPs-HA复合物可促进糖尿病创面的血管形成和神经再生，利于表皮层的重建，提高了皮肤胶原的合成，改善了再生皮肤的生物学性能。