论文部分内容阅读
目的：构建含人TRAIL114-281AA基因片段的真核表达载体pEGFPN1-TRAIL，同时以空载体pEGFPN1质粒为对照，转染人肝癌细胞系HepG2细胞，初步研究TRAIL基因是否能在HepG2细胞中过表达。为进一步的体外研究及体内研究奠定基础。方法：以FL15116质粒为DNA模板，PCR法扩增TRAIL114-281AA基因片段。胶回收试剂盒回收目的基因TRAIL片段，连接TRAIL片段与PMD18-T克隆载体，连接产物转化感受态细胞DH5，挑取单克隆菌落培养，提取质粒，经酶切及PCR鉴定后，送TAKARA公司测序，将测序正确的质粒命名PMD18-T-TRAIL，HindⅢ和BamHI限制性内切酶分别酶切质粒PMD18-T-TRAIL和pEGFPN1，胶回收TRAIL片段与pEGFPN1长片段，将TRAIL片段插入pEGFPN1长片段，经PCR及酶切鉴定后，将重组质粒pEGFPN1-TRAIL及空载体pEGFPN1采用脂质体转染法转染至HepG2细胞，RT-PCR法检测TRAIL基因的表达情况。结果：PCR扩增出TRAIL114-281AA基因片段，与PMD18-T连接产物PMD18-T-TRAIL重组质粒经PCR及酶切鉴定均得到一条约500bp大小的目的基因条带，经基因测序，比对测序结果序列正确且均无突变。TRAIL片段与pEGFPN1长片段连接产物pEGFPN1-TRAIL重组质粒，经PCR及酶切鉴定得到一条约500bp大小的目的基因条带。将pEGFPN1-TRAIL重组质粒成功转染至人肝癌细胞系HepG2细胞，荧光显微镜下观察到细胞在蓝色激发光下发绿色荧光，RT-PCR法检测出TRAIL片段在肝癌细胞系中高表达。结论：成功构建了表达人TRAIL114-281AA基因片段的真核表达载体pEGFPN1-TRAIL重组质粒。脂质体法分别转染pEGFPN1-TRAIL重组质粒及空载体pEGFPN1质粒入HepG2细胞后，RT-PCR检测实验组TRAIL基因在HepG2细胞中过表达。为下一步研究TRAIL114-281AA基因片段对肝癌作用的体外功能研究及体内实验奠定了基础，TRAIL基因有望成为治疗肝癌的一种新型基因疗法。