目的:乳腺癌是严重威胁女性健康的第一位恶性肿瘤。随着经济发展和人民生活水平的提高,乳腺癌的发病率呈现上升的趋势,肿瘤复发和远处转移是乳腺癌患者主要的死亡原因。乳腺癌的发生和发展机制至今仍未完全阐明,临床尚缺乏有效的治疗措施。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER2/neu、erbB-3和erbB-4四大成员,属于Ⅰ型酪氨酸激酶受体,酪氨酸磷酸化可使受体活化,控制着细胞的增殖、分化、移动和存活,受体的表达失调与肿瘤的发生相关。HER2是细胞来源的癌基因,在正常情况下处于非活化状态,参与细胞生长、分化的调节,在乳腺癌的研究中,HER2的扩增和过度表达研究最为深入,见于30%的乳腺癌,与乳腺癌的浸润和扩散有关,曲妥珠单抗(Trastuzumab、Herceptin、赫赛汀)是针对HER2强阳性表达乳腺癌首选的生物靶向治疗药物。但临床有19%乳腺癌的HER2、雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)均为阴性,且易发生复发和转移,预后较差,目前仍无有效的治疗靶点。研究发现EGFR蛋白在此类乳腺癌呈现过表达,且乳腺癌的表型与EGFR蛋白、淋巴结转移相关。EGFR是细胞膜的跨膜受体,与细胞的增殖、分化、运动、存活有关。正常细胞表达适量的EGFR,用于维持细胞的生命活动,但其过表达或活性增强可持续启动细胞增生信号的传递系统,致细胞过度增殖和表型恶化。EGFR在超过35 %～50 %的乳腺癌组织中表达。EGFR的表达与乳腺癌患者的预后有关,其表达越多则乳腺癌的预后越差,有淋巴结转移的乳腺癌的EGFR表达明显高于无淋巴结转移者。EGFR酪氨酸的磷酸化是EGFR信号转导过程中的关键分子事件,EGFR的磷酸化程度决定着肿瘤的预后,EGFR磷酸化程度高,肿瘤的预后差。影响EGFR磷酸化的原因目前不清楚,因此本研究重点探讨影响EGFR磷酸化的分子,为寻找治疗肿瘤的新靶点奠定基础。细丝蛋白A(Filamin A,FLNa)又称为Filamin-1或ABP-280,是细胞内一种肌动蛋白结合蛋白,同时又是脚手架蛋白,在细胞浆内广泛分布,也可以跨膜分布或转位至细胞核。FLNa蛋白是以“V”形的同型二聚体存在,每个FLNa分子内含一个肌动蛋白结合区(actin-binding domain,ABD)、24个重复单位及两个绞链区。特殊结构决定其具有强大的功能:FLNa与肌动蛋白丝结合,有助于细胞运动,与细胞增殖、迁徙、血管形成和器官发生有关;FLNa为脚手架蛋白,将细胞内多种蛋白分子与细胞骨架连接,并募集细胞膜的共刺激分子,参与细胞内的多种重要功能的信号转导和细胞对外界刺激的反应。许多研究证实FLNa在恶性肿瘤细胞的表达增多。如肺癌细胞内FLNa的表达上调,与肺癌的迁徙、粘附和侵袭相关;前列腺癌细胞的胞浆内FLNa表达较正常前列腺组织显著增高,且有转移的前列腺癌FLNa的表达高于无转移者;乳腺癌细胞内也存在FLNa高表达。通过免疫组化、流式细胞技术已观察到FLNa的表达量与乳腺癌的恶性度和转移相关,FLNa的表达随乳腺癌恶性度的增高而增加,有淋巴结转移的乳腺癌的FLNa表达明显高于无淋巴结转移者。Fiori和Zhu等对不同转移能力的黑色素瘤细胞系研究发现FLNa可影响EGFR的磷酸化(见第二部分文献2)。但是,FLNa是否也影响乳腺癌细胞的EGFR的磷酸化目前尚未见报道。为此,我们拟利用人乳腺癌细胞系,通过转染FLNa的siRNA降低FLNa表达、转染FLNa全长基因增加FLNa的表达后,观察EGFR的磷酸化水平及与EGFR磷酸化的相关的信号转导分子的变化;经免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,IP)证实FLNa与EGFR分子间的相互关系;利用MTT检测FLNa的表达对乳腺癌细胞增殖的影响。从组织、细胞和分子水平综合分析FLNa对EGFR磷酸化的调控,探讨FLNa调控EGFR磷酸化在乳腺癌发病中的作用,为有效治疗乳腺癌提供新靶点。第一部分细丝蛋白A在浸润性乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性方法:采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)免疫组织化学方法和流式细胞分析技术,检测46例分化程度不同的浸润性乳腺癌细胞中FLNa和增殖细胞核抗原(pro-liferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达情况,以正常乳腺组织或乳腺良性增生为阴性对照。结果:1. FLNa在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果:FLNa在正常乳腺上皮细胞的胞浆内少量表达(Fig. 1-1);FLNa在浸润性乳腺癌细胞阳性表达的程度较强,且随组织分化程度的降低而增高(Fig.1-2～4、Table 1-1),差异有统计学意义(P<0.05);有淋巴结转移乳腺癌细胞的FLNa的表达明显强于无转移组(Table 1-1),差异有统计学意义(P<0.05)。FLNa在浸润性乳腺癌细胞中的表达与组织学分型无关。流式细胞检测结果: FLNa在正常乳腺组织的表达量较少;在低分化乳腺癌细胞中FLNa的表达(1.22±0.13)明显高于中高分化的乳腺癌细胞(1.10±0.11),差异有统计学意义(P<0.05),见Fig.1-6、Table 1-2。无淋巴结转移者(1.21±0.11)明显高于有淋巴结转移者(1.10±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),见Table 1-2。FLNa在浸润性乳腺癌细胞中的表达与组织学分型无关。2. PCNA在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果:PCNA在浸润性乳腺癌细胞核呈阳性表达,PCNA的表达随乳腺癌分化程度的降低而增强,在低分化浸润性乳腺癌细胞的表达呈强阳性,见Fig.1-5。流式细胞检测结果:低分化浸润性乳腺癌细胞中PCNA的表达(1.65±0.22)明显高于中高分化乳腺癌(1.35±0.15),差异有统计学意义(P<0.05),无淋巴结转移的乳腺癌细胞PCNA的表达(1.42±0.15)明显低于有淋巴结转移者(1.56±0.16),差异有统计学意义(P<0.05),见Fig.1-7、Table 1-3。PCNA的表达与FLNa呈正相关(P<0.05)。第二部分FLNa对乳腺癌细胞表皮生长因子受体活化的影响方法:1.沉默FLNa的表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养乳腺癌MDA-MB-231细胞。实验分组:FLNa-siRNA转染组;通用HK对照转染组。每组分别经EGF(20nM)刺激后0min、5min和10min后收集细胞,提取蛋白,Western-blot检测各时间点FLNa、EGFR、磷酸化EGFR (p-EGFR)、ERK (extracellular signal-regulated kinase)和磷酸化ERK(p-ERK)蛋白的表达。2. FLNa过表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响细胞培养同方法1。实验分组:人FLNa-full(hfilamin A/pREP4质粒,内含FLNa全长基因)转染组;空质粒对照pcDNA3.1转染组。每组分别经EGF(20nM)刺激0min、5min和10min后收集细胞,提取蛋白, Western-blot检测各时间点FLNa、EGFR、p-EGFR、ERK和p-ERK蛋白的表达。3.免疫共沉淀证实FLNa对乳腺癌细胞EGFR的活化影响细胞培养同方法1。用含10%胎牛血清的DMEM培养液调细胞浓度为3.5×105/ml,接种至60mm培养皿。实验分组:转染FLNa-siRNA组;转染通用HK对照组。每组分别经EGF(20nM)刺激0min和10min后,收集细胞,提取蛋白,对提取的蛋白分别用抗EGFR抗体和抗磷酸化酪氨酸的4G10抗体免疫共沉淀,Western-blot分别检测沉淀蛋白内p-EGFR和EGFR的水平。结果:1.沉默FLNa的表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响1.1 FLNa蛋白的表达:FLNa-siRNA转染组FLNa的表达(1.40±0.10、1.27±0.06)较HK对照组(3.97±0.29、3.33±0.06)明显减少,差异有统计学意义(均P<0.01),见Fig.2-1、Table 2-1。1.2 EGFR蛋白磷酸化水平:EGF刺激5min、10min后,FLNa-siRNA转染组的EGFR磷酸化水平(0.73±0.01、0.37±0.05)明显低于HK对照组(1.08±0.01、1.30±0.06),差异有统计学意义(均P<0.01),见Fig.2-2、Table 2-2。1.3 ERK磷酸化水平:EGF刺激5min、10min后,FLNa的siRNA转染组ERK磷酸化水平(0.17±0.00、0.12±0.04)明显低于HK对照组(0.32±0.02、0.54±0.04),差异有统计学意义(均P<0.01),见Fig.2-3、Table 2-3。2. FLNa过表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响2.1 FLNa的表达:FLNa-full质粒转染组FLNa的表达(5.93±0.38、6.07±0.32)明显高于空质粒pcDNA3.1对照组组(4.50±0.20、4.60±0.17),差异有统计学意义(均P<0.01),见Fig.2-4、Table 2-4。2.2 EGFR蛋白磷酸化水平:EGF刺激5min、10min后,FLNa-full质粒转染组EGFR的磷酸化水平(1.53±0.11、0.86±0.14)明显高于空质粒pcDNA3.1对照组(0.57±0.01、0.44±0.02),差异有统计学意义(分别P<0.01,P<0.05),见Fig.2-5、Table 2-5。2.3 ERK磷酸化水平:EGF刺激5min、10min后,FLNa-full质粒转染组ERK的磷酸化水平(1.83±0.07、1.06±0.07)明显高于空质粒pcDNA3.1对照组(0.74±0.01、0.59±0.03),差异有统计学意义(均P<0.01),见Fig.2-6、Table 2-6。3.免疫共沉淀证实FLNa对乳腺癌细胞EGFR活化的影响3.1 FLNa-siRNA转染后FLNa的表达:FLNa-siRNA转染组FLNa的表达(3.53±1.08、4.33±1.33)较HK对照组(7.23±2.20、7.53±1.86)组明显减少,差异有统计学意义(均P<0.01)。见Fig.2-7、Table 2-7。3.2经抗EGFR抗体免疫沉淀后的EGFR磷酸化的水平: EGF刺激10min后,FLNa-siRNA转染组的EGFR磷酸化水平(1.09±0.09)明显低于HK对照组(2.32±0.22),差异有显著性(P<0.01)。见Fig.2-8、Table 2-8。3.3经抗酪氨酸磷酸化4G10抗体免疫沉淀后EGFR的表达: EGF刺激10min时,FLNa-siRNA转染组的EGFR表达(0.42±0.01)明显低于HK对照组(1.07±0.01),差异有显著性(P<0.01),见Fig.2-9、Table 2-9。第三部分细丝蛋白A对乳腺癌细胞增殖的影响方法:细胞培养见第二部分的方法1。用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液调细胞浓度为9×103/ml,按100μL /孔体积接种于96孔板。实验分组:FLNa-siRNA转染组和HK对照组;FLNa-full质粒转染组和空质粒pcDNA3.1对照组。分别用不同浓度的EGF(4nM、20nM、100nM)刺激过夜,用MTT法检测细胞的增殖水平。结果:1.FLNa沉默后MDA-MB-231细胞增殖水平:在4nM、20nM、100nM浓度的EGF刺激下,FLNa-siRNA转染组细胞的增殖水平随刺激浓度的增加而增高, FLNa沉默后细胞的增殖水平(1.28±0.09、1.46±0.02、1.58±0.06)均低于对照组(1.55±0.12、1.62±0.06、1.68±0.12),差异有显著性(p<0.01),见Fig.3-1、Table 3-1。2. FLNa过表达后MDA-MB-231的细胞增殖水平:在4nM、20nM、100nM浓度的EGF刺激下,FLNa-full质粒转染组细胞的增殖水平随刺激浓度的增加而增高,但FLNa-full质粒转染组细胞的增殖水平(1.14±0.08、1.28±0.11、1.51±0.03)高于对照组(1.09±0.17、1.21±0.17、1.25±0.05),差异有显著性(P<0.01),见Fig.3-2、Table 3-2。结论:1. FLNa在正常乳腺组织少量表达;FLNa的表达随浸润性乳腺癌分化程度的降低而增高,且与淋巴结转移有关;FLNa的表达与乳腺癌细胞的增殖能力呈正相关。2. FLNa的表达可调控乳腺癌细胞EGFR的磷酸化,磷酸化的EGFR又通过MAPK增殖信号传导通路活化ERK,影响乳腺癌细胞的增殖。3.沉默FLNa的表达导致乳腺癌细胞的增殖水平降低;FLNa的过表达则使乳腺癌细胞的增殖水平升高,表明FLNa可通过调控EGFR的活化影响乳腺癌的发生和发展。