燕子花花色成分鉴定及IlF3’H、IlF3’5’H基因克隆和表达模式研究

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花色是植物重要的观赏性状之一,蓝色花更是深受人们喜爱,由于蓝色花植物种类较少,致使蓝色花育种备受关注。燕子花(Iris laevigata)是鸢尾属一种抗寒性较强的水生蓝色花种类,花色艳丽,观赏价值高,其花色呈色机理相关研究鲜有报道,开展蓝色花色调控相关基因研究,对蓝色花色育种有着重要指导意义。本研究以燕子花为研究对象,通过对花被片主要代谢物成分分析,解析燕子花蓝色花形成的物质基础。结合燕子花转录组数据筛选并克隆出花色调控重要结构基因IlF3’H和IlF3’5’H,同时检测了IlF3’H和IlF3’5’H基因在燕子花花期及幼苗逆境胁迫下的表达特性;并成功构建了植物过表达载体,为花色和抗性转基因工程育种奠定基础。主要研究成果如下:1.通过代谢组检测鉴定到燕子花花被片中物质种类共计11类856种。其中类黄酮化合物种类数目最多,鞣质类、木脂素和香豆素物质种类数目最少;类黄酮化合物主要由黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、黄酮醇、花青素、黄酮碳糖苷、二氢异黄酮8种物质组成。发现燕子花花被片主要呈色物质是花青素,鉴定到燕子花的花青素苷共35种,包括矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素6大类。含量最高的是飞燕草素-3-O-葡萄糖苷,其次是矢车菊色素类,含量最少的是天竺葵色素类。根据花色代谢通路分析发现,飞燕草色素和矢车菊色素的前体代谢物分别是二氢杨梅素和二氢槲皮素,证明结构基因F3’H和F3’5’H在花青素呈色中都发挥重要作用。2.以燕子花花被片的cDNA为模板克隆出IlF3’H和IlF3’5’H基因的ORF序列,长度分别为1107bp和918bp。生物信息学分析发现,二者均为疏水性蛋白质,无信号肽,前者以苏氨酸酸化修饰为主,后者以丝氨酸磷酸化和苏氨酸酸化为主。二者均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,且IlF3’H蛋白有20G-FeⅡOxy结合位点同时也具有PcbC加氧酶位点。同源性比较发现,IlF3’H与美丽百合(Lilium speciosum)的蛋白同源性较高;IlF3’5’H与粗柄象腿蕉(Ensete ventricosum)的蛋白同源性较高,通过同源基因功能分析,推测IlF3’H和IlF3’5’H基因是花色调控的关键功能基因,也可能响应植物逆境胁迫。3.q-PCR结果显示IlF3’H和IlF3’5H基因在燕子花的花中表达量水平高于叶;在植株开花阶段,二者表达量均呈现先上升后下降趋势,IlF3’H和IlF3’5’H基因在花完全开放时期(S4)和花半开放时期(S3)的表达量较高。4.利用实时荧光定量检测IlF3’H和IlF3’5’H基因在燕子花幼苗低温胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式,结果发现:低温胁迫下,IlF35’H在叶中表达量较高,其响应表达位置主要在叶片上。而IlF3’H的主要发生位置则是在根中,且随着胁迫加深显著表达;干旱胁迫条件下,发现IlF3’H和IlF3’5 ’H基因在根中的表达量均高于叶中的表达量,二者均呈现一个先上升后下降的趋势,说明IlF3’H和IlF3’5’H可以通过上调表达来响应干旱和低温的恶劣变化;盐胁迫的条件下,IlF3’H在幼根的表达量远高于幼叶中的表达量,在幼根中上调表达,拥有明显且强烈的胁迫应答响应机制。而IlF35’H的表达量变化不大,对于盐胁迫仅有一定程度上的响应。5.使用双酶切法,对IlF3’H和IlF3’5’H添加酶切位点XbaI和BamHI,将两段基因片段分别与pBI121连接,最终成功构建了植物过表达载体pBI121-IlF3’H和pBI121-IlF3 ’5’H。
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