前言:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,据我国最新癌症统计数据显示,胃癌的发病率和死亡率在我国所有癌症中均高居第二位,是严重威胁我国居民健康的恶性疾病之一。在全球范围内,胃癌的发病率亦位列所有癌症中第五位,其死亡率高居所有癌症中第四位。尽管胃癌的临床诊疗水平有了很大的提高,但是胃癌患者的预后仍不理想。腹膜转移是造成胃癌不良预后的主要因素,亦是晚期胃癌最常见的远处转移方式,而且一旦发生胃癌腹膜转移,患者的生存时间通常不足半年。胃癌腹膜转移具有发病率高且预后差的特点。约10-20%胃癌患者在诊断时就已发生腹膜转移,接受胃癌根治术的患者中仍有约40-60%会在术后发生腹膜转移。然而,目前胃癌腹膜转移发生发展的分子机制仍不明确,是制约胃癌诊疗及预后的一个重要因素。因此,探索胃癌腹膜转移发生发展的具体分子机制及寻找有效的生物标志物和治疗靶点对提高胃癌的预后具有重大意义。胃癌腹膜转移是个多阶段的、复杂的细胞生物行为过程,在此过程中涉及多种类型细胞及分子信号参与。现阶段而言,“种子-土壤”学说（“Seed and Soil”Hypothesis）是目前被广泛接受且认可的机制假说。腹腔微环境在胃癌腹膜转移过程中充当“土壤”作用,是一个具有高度复杂性和异质性的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment,TME）,由各类细胞、细胞外基质及信号分子组成,可为肿瘤细胞的生长提供合适微环境,对肿瘤细胞的种植转移起到至关重要的作用,故腹腔微环境逐渐成为胃癌腹膜转移研究领域的热点及难点。对于作为“种子”的腹腔游离胃癌细胞来说,它是胃癌腹膜转移发生的始动因素,但是胃癌细胞进入腹腔后需要面对缺氧、免疫监视等恶劣条件。只有腹腔内的游离胃癌细胞抵御失巢凋亡并突破腹膜固有防御屏障后,才能启动胃癌腹膜转移过程。同时,胃癌细胞与腹腔微环境之间的交互作用对腹膜转移发生发展也起到关键作用。单细胞RNA测序技术可从单个细胞水平上对RNA进行转录组测序,并分析每个细胞的基因信息。基于此优势,单细胞RNA测序技术可从单细胞水平揭示各类肿瘤异质性并绘制相关疾病图谱,故该技术的出现也为全面解析胃癌腹膜转移过程中腹腔微环境的细胞图谱及其动态变化提供了强大的技术支持。因此,利用单细胞RNA测序技术全面解析腹腔微环境,将有助于更好地理解胃癌腹膜转移的分子机制,并为胃癌腹膜转移的精准诊疗提供新的思路和有力的证据支持。本研究一共收集了35例不同疾病阶段的临床样本,包括良性子宫肌瘤的正常腹腔冲洗液、早期胃癌的腹腔冲洗液、进展期胃癌的腹腔冲洗液和胃癌腹膜转移的恶性腹水,以此来模拟胃癌腹膜转移发生发展的多阶段过程。利用高通量的单细胞RNA测序技术,在单细胞水平上系统性地解析胃癌腹膜转移过程中腹腔微环境内的免疫细胞和胃癌细胞图谱及其动态变化,探索胃癌腹膜转移的分子调控机制,寻找胃癌腹膜转移的关键分子标志物和治疗靶点,为胃癌腹膜转移的精准诊疗提供科学依据。研究方法:本研究对不同疾病阶段的腹腔冲洗液及恶性腹水临床样本进行单细胞悬液制备和细胞质量检测,随后,利用单细胞RNA测序技术对样本进行单细胞测序。接着,使用Cell Ranger软件对原始的单细胞RNA测序数据进行测序数据拆分和细胞条形码处理,将原始测序数据比对到GRCh38人类参考基因组上,生成原始的基因-细胞表达矩阵。根据每个细胞的UMI（Unique Molecular Identifier）数、基因数和线粒体基因占比数评估每个细胞的质量,并过滤掉低质量细胞。同时用“Double Finder”来预测并去除潜在的双细胞或多细胞。随后,使用无监督聚类方法对腹腔微环境内的细胞进行细胞聚类分群并用UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）对结果进行可视化。基于差异基因、已知标记基因以及CNV（Copy Number Variations）分析对细胞类型进行鉴定,以全面解析腹腔微环境的免疫细胞和肿瘤细胞图谱。然后,利用细胞功能评分、GSEA富集分析以及SCENIC转录因子分析来探索腹膜转移过程中腹腔微环境内的细胞类型和细胞功能的多样性、复杂性、异质性及其动态变化。通过“monocle”拟时序分析揭示腹腔微环境内不同细胞之间的分化轨迹及其潜在的分子调控机制。此外,运用Cell Phone DB细胞间互作分析和GSVA代谢通路活性分析探索腹腔内胃癌细胞和免疫细胞间的细胞通讯关系以及治疗诱导的胃癌细胞适应性进化。最后,我们对胃癌腹水进行类器官培养,结合腹水类器官模型和TCGA数据库对单细胞结果进行体外验证实验和药物干预实验,以进一步探索相关抑制剂对胃癌腹膜转移的阻断作用。结果:本研究对35名病人的临床样本进行了单细胞RNA测序,共获得191987个高质量的单细胞RNA转录组数据,并系统性地解析了胃癌腹膜转移发生的多阶段过程中腹腔微环境的细胞图谱及其动态变化。我们发现了腹腔微环境内存在各类免疫细胞,如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞等,表明了腹腔微环境内的免疫细胞类型具有多样性、复杂性及异质性。我们发现了一群具有低抗原呈递能力、高增殖能力的CD14+/CD1C+树突状细胞,该细胞亚群高表达SPP1、STAB1等促血管生成相关基因,具有较强的促血管生成作用,在腹膜转移阶段呈现细胞比例增多,且随着疾病进展,其促血管生成功能明显上调而抗原呈递功能下调。在腹膜转移阶段的腹腔微环境中也富集了大量的M2型肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophage,TAM）,其促血管生成能力显著增强。本研究还发现,T细胞在胃癌腹膜转移过程中呈现出差异性动态变化。在腹膜转移阶段,Treg和na（?）ve CD4 T细胞比例增多,细胞毒性效应性CD8T细胞的细胞比例及其细胞毒性功能下降。同时,腹腔微环境内存在一群MKI67+/STMN1+/PCNA+增殖性的cycling T细胞,其细胞毒性低表达（如GNLY、GZMA和NKG7）伴免疫检查点高表达（如TIGIT、TNFRSF9、CD47、ENTPD1和CTLA4）,提示该细胞亚群处于T细胞功能耗竭状态,且在腹膜转移时富集。此外,腹腔微环境内的树突状细胞和T细胞分别都存在细胞间的分化与发育轨迹,在分化过程中细胞发生代谢重编程及功能重塑,导致其免疫功能障碍。因此,在腹膜转移过程中,髓系细胞和淋巴细胞的状态转化及功能重塑将腹腔微环境改造成利于胃癌细胞增殖和种植转移的免疫抑制性微环境。另外,作为“种子”的腹腔内胃癌细胞也具有高度异质性,我们鉴定出了一群具有高可塑性的胃癌细胞亚群,这类胃癌细胞亚群通过一种称为逆生的自噬依赖性细胞程序向高增殖性表型转化,以应对腹腔内恶劣微环境所带来的细胞生存压力,也发现自噬相关基因MARCKS能特异性标记预后较差的高可塑性胃癌亚群,且自噬抑制剂能显著诱导病人来源腹水类器官凋亡,阻断其生长。此外,胃癌细胞在抗肿瘤治疗后发生细胞功能重塑及代谢重编程等适应性进化,而腹腔内的免疫细胞与胃癌细胞之间存在的通讯作用可维持胃癌细胞的干性和可塑性。结论:本研究应用单细胞RNA测序技术从单细胞水平全面解析了胃癌腹膜转移过程中腹腔微环境内的免疫细胞和肿瘤细胞图谱,表明腹腔微环境内细胞具有高度复杂性和异质性,揭示了各类细胞在不同疾病阶段的动态变化及功能转化特征谱。我们发现了多个与胃癌腹膜转移相关的促血管化及免疫抑制状态的免疫细胞亚型,将腹腔微环境重塑成促转移的微环境。腹腔内胃癌细胞通过细胞功能重塑及代谢重编程获得增殖转移能力,但可通过自噬抑制剂阻断胃癌细胞的生长。本研究有助于阐明胃癌腹膜转移发生发展的分子机制及其调控网络,为胃癌腹膜转移的个体化精准医疗提供新的思路和坚实的基础。