研究背景氧化应激（oxidative stress）是心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤的中心环节，MI/R过程中产生大量活性氧族（ROS）可直接或间接影响心脏功能，促使心肌细胞凋亡和坏死。线粒体既是内源性ROS（包括超氧阴离子，过氧化氢，过氧亚硝酸盐和羟基自由基）产生的主要来源又是其作用靶点。线粒体功能障碍将导致ROS产生增加，加剧氧化剂诱导的凋亡。再灌注早期，ROS爆发会改变细胞内的氧化还原状态，引起线粒体内膜电位变化，从而促使线粒体细胞色素C释放入胞质，最终激活凋亡执行分子caspase-3,引发细胞凋亡。因此阻止组织和细胞内ROS的过量产生和维持线粒体的完整性是对抗MI/R损伤的有效手段。中国传统药用植物人参中提取的活性单体成分——人参皂甙Rd（GinsenosideRd，GSRd），以其高亲脂、易通过生物膜和独特的药理学作用备受关注。研究表明GSRd可以抑制ROS生成，修复受损的自由基清除系统，具有抗氧化作用。我们的研究组前期研究发现GSRd在治疗短暂局灶性脑缺血损伤中发挥一定的神经保护作用。因此，我们推测GSRd在MI/R损伤中可能会有心肌保护作用。本实验研究旨在明确GSRd对缺血心脏是否具有心肌保护作用及其主要机制，以期为GSRd有效、合理应用于临床治疗急性MI/R及相关疾病提供理论依据和参考资料。实验目的1.探讨GSRd是否可减轻MI/R损伤，对缺血/再灌注（I/R）心脏具有保护作用2.明确GSRd能否减少MI/R诱导的氧化应激3.进一步探究GSRd抗线粒体凋亡的主要机制实验方法1.动物实验：Sprague-Dawley雄性大鼠，常规建立大鼠急性MI/R（30min/3h）模型。将SD大鼠随机分为3组（n=8）：1）假手术组（Sham）：开胸，但不结扎冠状动脉，于缺血开始前的30min腹腔注射生理盐水10ml/kg；2）模型组（MI/R）：于缺血开始前的30min腹腔注射生理盐水10ml/kg，缺血30min，再灌注3h；3）药物组（MI/R+GSRd）：于缺血开始前的30min腹腔注射GSRd50mg/kg，缺血30min，再灌注3h。全程持续监测血压、心率及心脏功能；采用伊文氏兰-TTC双染法测定心肌梗死面积；采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位平端标记法（TUNEL）原位检测心肌细胞凋亡；利用分光光度计法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平。2.离体实验：原代分离培养乳鼠心肌细胞（NRC），给予缺氧/复氧（3h/2h）处理模拟缺血/再灌注（SI/R）。培养的NRC随机分为4组：1）常氧对照组（Control），Tyrode液孵育细胞，常规培养5h;2）模型组（SI/R），模拟缺血（SI）缓冲液孵育细胞，37℃缺氧小室培养3h后，更换模拟再灌注（SR）缓冲液孵育细胞，常规培养2h;3）溶剂对照组（Vehicle），SI/R开始前30min给予0.2%（v/v）DMSO孵育细胞；4）药物组（SI/R+GSRd），SI/R开始前30min给予GSRd（10μM）孵育细胞，该药物剂量是根据前期剂量效应实验基础上确定。采用MTT检测心肌细胞存活率；通过检测乳酸脱氢酶（LDH）释放分析心肌细胞损伤情况；采用Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测细胞凋亡率；利用荧光探针检测心肌细胞ROS生成、线粒体膜电位；采用免疫印迹法检测凋亡线粒体途径中细胞色素C，caspase-9, caspase-3, Bcl-2家族蛋白及P-Akt/P-GSK-3β蛋白的表达及磷酸化水平。实验结果1.在体实验结果表明：各组间缺血前基础水平（Baseline）的左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室最大上升/下降速率（±LVdP/dtmax）等血流动力学指标无明显差异；各处理组间心率（HR）和平均动脉压（MABP）亦无显著差异。实验伊始至结束的I0（缺血0min）、I30（缺血30min）、R60（再灌注60min）及R180（再灌注180min）各时间点上，MI/R组与Sham组相比LVSP及±LVdP/dtmax明显降低（P<0.01），LVEDP显著升高（P<0.01）。另一方面，MI/R+GSRd组上述时间点各指标虽不及Sham组；但与MI/R组相比，MI/R+GSRd组能在I0、I30、R60及R180各时间点上明显提高LVSP和±LVdP/dtmax（P<0.01）及显著抑制LVEDP（P<0.01），从而增强大鼠缺血后心脏功能恢复。提示GSRd可以改善MI/R心脏收缩/舒张功能，促进再灌注心肌的功能恢复。2.与Sham组相比，MI/R组大鼠心肌梗死面积，血清CK、LDH水平及心肌TUNEL阳性细胞和Caspase3活性均明显增加。GSRd可显著减少梗死面积（20.9%±2.3%vs.36.0%±1.5%MI/R-group, P<0.01，n=8），降低CK、LDH水平（2,238±160U/Land1,320±109U/L vs.3,324±228and2,327±143U/L respectively, P<0.01），减少TUNEL阳性细胞（11%±2.3%vs.16.3%±1.8%，P<0.01），降低Caspase-3活性（1.9±0.3vs.3.0±0.2, P<0.05）。结果提示GSRd可减轻MI/R引起的心肌梗死、细胞坏死和细胞凋亡，发挥心肌保护作用。3.体外实验结果表明：GSRd（0.1-50μM）常规常氧孵育细胞24h，各组间细胞存活率和LDH漏出率没有显著性差异，说明GSRd在该浓度范围内对心肌细胞是无毒安全的。与常氧对照组相比，缺氧3h复氧2h导致心肌细胞存活率显著降低（41%±0.6%vs.82%±1.1%，P<0.01），LDH漏出率增加（16.33%±2.3%vs.5.8%±0.7%，P<0.01），Annexin V/PI双染凋亡细胞明显增多（19.9%±1.1%vs.3.1%±0.2%, P<0.01）。GSRd（0.1,1, and10μM）可明显提高细胞存活率（59%±1.8%,63%±3.9%,69%±3.7%，P<0.01），降低LDH漏出率（11%±1.7%,10.3%±0.9%,7.3%±0.9%，P<0.05），减少凋亡细胞（6.3%±0.7%, P<0.01）。结果表明GSRd可减轻SI/R引起的心肌细胞坏死，发挥抗凋亡、保护心肌细胞的作用，且该作用在0.1-10μM浓度范围内呈量效关系。4.与常氧对照组相比，缺氧3h复氧2h后细胞内ROS生成明显增加，同时抗凋亡蛋白分子Bcl-2的表达降低，促凋亡蛋白分子Bax表达增加，Bcl-2与Bax比值降低，细胞线粒体膜电位显著降低（P<0.01）。线粒体膜电位去极化促使细胞色素C等凋亡蛋白，从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤。GSRd可显著减少SI/R诱导的细胞内ROS产生，促使Bcl-2/Bax比值增加，稳定线粒体膜电位，抑制细胞色素C（Cyt-C）的释放（0.9±0.03vs.0.7±0.02, P<0.05），进而阻止caspase-9和caspase-3活化过程（P<0.01）。这些结果提示GSRd可通过凋亡线粒体途径抑制SI/R诱导的心肌细胞凋亡。此外，为进一步阐明GSRd抗心肌细胞凋亡的作用机制，我们检测了SI/R处理后乳鼠心肌细胞Akt和GSK-3β磷酸化水平。结果显示各组间总Akt和GSK-3β表达无明显差异。GSRd可有效促进SI/R心肌Akt和GSK-3β磷酸化水平。PI3K抑制剂LY294002可显著降低GSRd激活的SI/R心肌Akt及GSK-3β的磷酸化水平。表明GSRd的心肌保护机制与激活Akt/GSK-3β信号通路有关。结论1.在整体动物心脏及体外培养的乳鼠心肌细胞上均发现GSRd减轻MI/R损伤。表现为GSRd改善大鼠MI/R后心脏功能，减小心肌梗死面积和降低心肌细胞凋亡；增加SI/R乳鼠心肌细胞存活率，降低细胞LDH漏出率及减少心肌细胞caspase-3和caspase-9活性。2.首次揭示GSRd可减少心肌细胞内ROS的产生，通过抑制线粒体凋亡通路减轻SI/R诱导的心肌细胞凋亡。3. GSRd激活Akt/GSK-3β信号通路可能参与抗SI/R诱导的心肌细胞凋亡。上述结果提示GSRd具有抗氧化应激、抗凋亡、保护缺血/再灌注心脏的作用，其机制与抑制线粒体凋亡通路及激活Akt/GSK-3β信号通路有关。从而为植物药GSRd应用于临床防治急性MI/R损伤及相关疾病提供了新的实验证据和理论依据。