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研究背景结核病(tuberculosis,TB)是导致人类死亡的十大原因之一,每年致使数百万人感染。尽管结核病治疗的成功率很高,绝大多数患者可通过规范用药被治愈,但TB作为本世纪危害人类健康的严重传染病之一,在世界范围内并未得到很好的控制,反而呈恶化趋势。同时感染人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)人数的增多以及移民的增加均促使了结核病的流行,使其更加难以控制。流行病学研究表明,结核病已经成为威胁人类健康的公共卫生问题,其中肺结核(Pulmonary tuberculosis,PTB)患病人数占比最大。目前,结核病检测主要是通过痰液涂片或培养寻找MTB,取材质量的优劣直接影响检测结果从而使这些方法存在较大的局限性,且MTB生长周期较长,需要培养足够长时间才能明确诊断。因此,在患者感染MTB的早期,医生往往只能采取经验性治疗。为使结核病的流行得到有效控制,亟需一种及时有效的诊断方法。长链非编码RNA(Longnon-coding RNAs,lncRNAs)是指长度超过200个核苷酸且无蛋白编码能力的RNA,具有较高的组织特异性和较低的序列保守性。近年来,越来越多的证据表明lncRNAs通过染色质重塑、转录调控、转录后处理等多种方式调控基因表达,进而调节多种生物学过程进而参与疾病的发生发展,在癌症、代谢性疾病、免疫缺陷病等疾病中受到广泛关注。lncRNAs参与细胞介导的免疫学机制在TB免疫保护体系中发挥了重要作用;同时也参与介导在感染MTB时体内巨噬细胞的凋亡和自噬;在利用痰液和血浆样本诊断活动性PTB、陈旧性PTB研究中发现lncRNAs具有成为生物标志物的潜力。但是,目前还未发现能成熟应用于临床诊断结核病的lncRNA。研究目的活动性PTB患者与健康人群血浆中差异表达的lncRNAs,探讨其临床应用价值。材料和方法数据挖掘:为了寻找活动性TB患者外周血中异常表达的lncRNAs,我们对GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中的GSE94907进行再分析,比较健康对照(Healthy control,HC)(GSM2491733、GSM2491734)和活动性 TB(GSM2491737、GSM2491738)两组数据,筛选显著差异表达的lncRNA(FC>2,q<0.05)并绘制热图、火山图等,同时进行靶基因预测。为了筛选可用于临床检测及诊断的lncRNA,我们挑取FKPM>5且定位于常染色体上lncRNAs。作为非编码RNA重要的数据库,NONCODE提供了 lncRNA在活动性TB与健康人外周血外泌体中的表达情况。进一步将筛选到的lncRNAs在NONCODE数据库中进行信息确认,获得与NONCODE数据变化趋势一致的lncRNAs。实验组及正常对照组:本实验共收集山东省胸科医院2018年6月至2019年11月PTB患者血浆69例作为实验组(活动性PTB),其中包括初治、复治活动性PTB,年龄在15～79岁之间。69例健康查体血浆标本取自山东大学第二医院作为对照组(HC),年龄在17～69岁之间。根据人民卫生出版社《内科学》(第8版)中结核病诊断标准,所有活动性肺结核患者均根据临床表现及典型胸部CT、痰液或支气管肺泡灌洗液中MTB抗酸染色、核酸检测、结核抗体等辅助检查结果确诊。健康对照组人员和实验组患者既往无糖尿病、高血压、免疫缺陷性疾病、肿瘤等有关基础疾病。实验组与对照组在年龄、性别方面差异无统计学意义。血浆lncRNAs样本提取:提取EDTA-K2抗凝后的血浆138例,包括69例患者和69例健康人群标本。所有血浆样本均采用病毒RNA提取试剂盒(天根)提取总RNA。用超微分光光度计(天根)测定RNA浓度,保存于-80℃。PBMC中样本提取:提取EDTA-K2抗凝全血中PBMC细胞,通过RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(天根)提取RNA,用超微分光光度计(天根)测定RNA浓度,保存于-80℃。提取 RNA 后,使用 PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒(Takara,China)将500 ng RNA样品通过逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)生成互补DNA(cDNA),并在-20℃保存。lncRNA表达测定:使用ABI-7500运行实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR,qPCR)程序测定 lncRNAs 表达,使用 SYBRPremix Ex TaqTM(TliRNaseHPlus)(Takara,China)试剂盒作为反应体系,SYBR为荧光染料,GAPDH基因作为内参进行测定,lncRNAs表达水平使用如下方法计算,lncRNAs 表达量为 2-△△Ct。△Ct=Ct-CtGPADH△△Ct=△CtPTB-△CtHC采用SPSS19.0统计分析软件,计量资料使用独立样本T检验,计数资料分析采用卡方检验。实验结果与健康对照组相比,841个lncRNAs在活动性TB患者外周血中显著低表达,351个lncRNAs显著高表达。其中,111个显著低表达的lncRNAs和1个高表达lncRNA定位于常染色体且FKPM>5。通过与NONCODE数据库信息确认,我们获得了 9个与NONCODE数据变化趋势一致的lncRNAs:NONHSAT004992.2、NONHSAT036869.2、NONHSAT006652.2、NONHSAT078957.2、NONHSAT101518.2、NONHSAT148822.1、NONHSAT131809.2、NONHSAT067134.2、NONHSAT257478.1。根据qPCR检测lncRNAs在健康对照组和PTB患者血浆中含量相比:4个下调 lncRNAs 分子(NONHSAT101518.2、NONHSAT067134.2、NONHSAT148822.1、NONHSAT078957.2)P<0.05,差异具有统计学意义。根据qPCR检测lncRNAs在健康对照组和PTB患者PBMC中含量相比,2个lncRNAs分子:NONHSAT078957.2(t=4.836,p<0.001)和 NONHSAT101518.2(t=6.969,p<0.0001)表达量显著下调。绘制血浆中4个lncRNAs分子的受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC),NONHSAT101518.2 敏感度为 0.9502(95%CI,0.9153-0.9852);NONHS AT148822.1(0.7080,95%CI,0.6207-0.7954);NONHS AT078957.2(0.8994,95%CI,0.8443-0.9545);NONHSAT067134.2(0.8725,95%CI,0.8064-0.9386)。实验结论NONHSAT101518.2、NONHSAT067134.2、NONHSAT148822.1、NONHSAT 078957.2在活动性肺结核及健康人群血浆及PBMC中表达量存在一定的统计学差异,对及时、准确诊断活动性肺结核具有一定指导意义,有望成为快速诊断结核病的潜在分子生物学标志物。