论文部分内容阅读
斑马鱼容易大规模饲养,由于胚胎易得、便于体外观察等优点而成为一种越来越受欢迎的模式脊椎动物。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度不小于200 bp的不具有编码能力的RNA,其表达水平一般低于蛋白编码基因,与蛋白编码基因相比,lncRNA在更窄的时间窗内表达,并且在早期胚胎中特别丰富。一些lncRNA具有组织特异性表达以及保守的二级结构、剪接形式、精确的亚细胞定位,参与生长发育、分化、细胞凋亡等重要过程,在动物胚胎发育和组织器官形成过程中有重要的调控作用。文献报道lncRNA生长阻滞特异转录物5（growth arrest specific transcription 5,gas5）是哺乳动物肌肉生长和细胞凋亡的关键调控转录本,但其对斑马鱼胚胎肌肉发育调控的研究很少。本研究以斑马鱼胚胎为实验对象,通过高通量测序方法筛选到在胚胎肌肉发育过程中差异表达的lncRNA gas5,并利用q PCR、原位杂交、CRISPR/Cas9等实验方法技术对lncRNA gas5在斑马鱼胚胎肌肉发育过程中的表达及其功能进行研究,旨在揭示斑马鱼早期胚胎肌肉发育过程中lncRNA gas5可能的调控功能,为肌肉相关疾病的研究和治疗提供基础研究资料。主要实验结果如下:1.本实验选择斑马鱼胚胎肌肉发育的3个关键时期（受精后10 h（10 hours post fertilization,10 hpf）、24 hpf、36 hpf）进行长链非编码RNA测序。测序结果显示,24 hpf（T2）和10 hpf（T1）相比共筛选出1 486个差异性表达的lncRNAs,其中843个lncRNAs上调,643个lncRNAs下调;36 hpf（T3）和24 hpf（T2）相比共筛选出844个差异性表达的lncRNAs,其中482个lncRNAs上调,362个lncRNAs下调;36 hpf（T3）和10hpf（T1）相比共筛选出2 137个差异性表达的lncRNAs,其中1 148个lncRNAs上调,989个lncRNAs下调。测序结果表明,这3个时期基因活跃程度比较高。2.在T1和T3组下调的989个lncRNAs中筛选出了保守性较好的lncRNA gas5。3.Ensembl数据库显示,lncRNA gas5位于斑马鱼8号染色体上,有14个外显子,转录本长度为799 bp,属于基因间长链非编码RNA（lincRNA）。4.qPCR结果显示,在斑马鱼胚胎发育的不同时期（0、2、6、10、16、24、36、48、72、96 hpf）lncRNA gas5均表达;除了0 hpf,肌肉发育标记基因myog在斑马鱼胚胎发育不同时期均表达;除了0 hpf和2 hpf,肌肉发育标记基因myod1在斑马鱼胚胎发育不同时期均表达;且lncRNA gas5的表达与myog和myod1基因的表达呈现出一致的趋势。原位杂交结果显示,lncRNA gas5在胚胎发育早期呈现出泛表达模式,随后主要在眼睛、大脑、脊髓中表达;myog表达于斑马鱼胚胎发育早期,随后呈现出组织特异性,主要在体节表达;myod1表达于斑马鱼胚胎发育早期,随后呈现出组织特异性,主要在体节、眼睛表达。5.qPCR结果显示,在斑马鱼成鱼不同器官中lncRNA gas5均有不同程度的表达,其表达强度依次为:脑﹥眼﹥肾脏﹥脾脏﹥肌肉﹥尾﹥肝脏﹥心脏。6.利用CRISPR/Cas9技术敲除lncRNA gas5,并在注射24 h后提取基因组DNA进行测序,测序结果显示,与NI组（胚胎未注射任何物质）和对照组（胚胎仅注射Cas9蛋白）相比,敲除组在靶位点之后出现均匀分布的套峰,表明该基因可能产生了突变。7.利用CRISPR/Cas9技术敲除lncRNA gas5后,q PCR和原位杂交结果均显示,与对照组相比,敲除组lncRNA gas5的表达量降低。8.利用CRISPR/Cas9技术敲除lncRNA gas5后,统计胚胎发育过程中的死亡率、畸形率,结果显示敲除组胚胎的死亡率和畸形率均高于NI组和对照组。且观察到的胚胎发育畸形有卵黄延伸部膨大、眼睛变小或缺失、两个耳石不分离等。9.利用CRISPR/Cas9技术敲除lncRNA gas5后,通过q PCR检测10个斑马鱼胚胎肌肉发育相关基因mef2ca、nkx2.5、myhc4、srfa、myod1、myog、myf5、pax3a、pax7a、myf6的表达。结果显示,在lncRNA gas5相对表达量下调后,敲除组mef2ca、myod1、myog、myf5、pax3a、pax7a的表达量与对照组相比均显著下调;myhc4的表达量与对照组相比显著上调;nkx2.5、srfa、myf6的表达量与对照组相比没有显著变化。10.利用CRISPR/Cas9技术敲除lncRNA gas5后,通过q PCR检测其5个邻近基因tor3a、osbpl9、calr、si:ch211-198n5+11、rpe65b的表达。结果显示,在lncRNA gas5相对表达量下调后,敲除组tor3a的表达量与对照组相比极显著下调;osbpl9、calr的表达量与对照组相比极显著上调;si:ch211-198n5+11、rpe65b的表达量与对照组相比没有统计学显著变化。本研究通过相关文献和斑马鱼胚胎肌肉发育的3个关键时期的高通量测序,筛选到可能与肌肉发育相关的基因lncRNA gas5。实验结果也表明,lncRNA gas5在斑马鱼肌肉中的相对表达量比较高,而且其表达与myog和myod1基因的表达呈现出一致的趋势,在斑马鱼胚胎肌肉发育过程中可能有调节作用。LncRNA gas5敲除后对肌肉发育相关基因以及其邻近基因的表达产生了一定影响,说明该lncRNA对斑马鱼胚胎肌肉的发育及其邻近基因的表达具有一定调节作用,但是否与肌肉发育标记基因存在具体的相互作用以及作用的分子机制还需深入的研究工作。本实验结果为进一步研究lncRNA gas5在斑马鱼胚胎发育过程中的作用提供了实验依据,这对揭示斑马鱼早期胚胎肌肉发育的机制有一定的意义,也为肌肉相关疾病的研究和治疗提供了基础研究资料。