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我国是结核病高负担国家,结核病疫情位居全球第二,结核病特别是耐药结核病已对我国公共卫生构成严重威胁。耐药结核病（Drug-resistant tuberculosis,DR-TB）尤其是耐多药结核病（Multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB）和广泛耐药结核病（Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB）的出现和流行严重阻碍了结核病的有效防控。我国结核病耐药情况存在明显的地区差异,统一标准化的防控策略对区域性防控工作的指导有一定的局限性。针对特定地区开展结核病耐药性监测和分子流行病学研究有助于掌握其耐药特征、耐药产生原因和变化趋势,为指导临床用药、改善防控策略、实施精准防控、实现分类指导和因地制宜的采取科学防治对策提供科学参考。本研究以2013-2017年湖南省国家结核病耐药监测点的菌株为研究对象,从以下三个方面展开研究分析。首先,应用微孔板法对湖南省国家耐药监测点（哨点）五年（2013-2017年）内分离得到的1416株结核分枝杆菌进行12种抗结核药（4种一线,8种二线）的药物敏感性检测,采用耐药率、耐药谱、耐药趋势三个指标分析该地区结核病的耐药特征,同时采用Logistic回归分析了 MDR-TB的相关危险因素。结果显示,1416株临床分离株中,87.43%（1238/1416）来自初治结核病患者,12.57%（178/1416）来自复治结核病患者。总体来讲,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药率为13.70%（194/1416）,对利福平的耐药率为8.40%（119/1416）,耐多药率为6.99%（99/1416）。在 MDR-TB 中有 30.30%（30/99）和 4.04%（4/99）为 Pre-XDR-TB（Pre-extensively drug-resistant tuberculosis,广泛耐药结核病前期）和XDR-TB。耐药趋势分析结果显示,湖南地区结核病耐药率未呈现明显下降趋势（χ2趋势=3.045,P=0.081）,对氟喹诺酮类（FQs）的耐药率呈现逐年上升趋势（χ2趋势=5.886,P=0.015）,鉴于FQs是治疗MDR-TB的核心药物,临床上应加强对其规范化使用。耐药相关性分析结果显示四种一线抗结核药两两间存在较强相关性,尤其是利福平和异烟肼表现为强相关（r=0.61）,其余均表现为中度相关（r>0.4）。MDR-TB相关危险因素分析结果显示,复治是发生耐多药结核病的独立危险因素（OR=4.054[95%CI:2.536-6.842],P<0.001）。研究结果显示湖南地区的MDR-TB率约为7%,处于较高水平（全球平均水平约为3.5%）,并且连续多年未呈现下降趋势,说明该地区对耐药结核病的防控尚未取得明显效果。考虑到一线抗结核药交叉耐药现象严重且耐药谱复杂,提示基于药敏试验的个体化治疗至关重要。本研究还检测了所有MDR菌株对新型抗结核药[贝达喹啉（BDQ）、德拉马尼（DLM）、利奈唑胺（LZD）、氯法齐明（CFZ）]的敏感性,以期为该地区新型抗结核药应用于MDR-TB的治疗提供证据支持。90株MDR-TB获得可靠药敏结果,包括59株简单MDR-TB,27株Pre-XDR-TB和4株XDR-TB。研究结果显示,DLM对 MDR-TB 的杀菌作用最强,MIC50和 MIC90分别为 0.015μg/mL 和 0.06μg/mL,其次为 BDQ（MIC50=0.06μg/mL,MIC90=0.012μg/mL）和 CFZ（MIC50=0.12μg/mL,MIC90=0.50μg/mL）,LZD的杀菌作用相对较弱,MIC50和MIC90均为0.5μg/mL。MDR菌株对BDQ和DLM的耐药率分别为1.11%（1/90）和3.33%（3/90）,未检测到对CFZ和LZD耐药的菌株。本研究结果证实了 BDQ、DLM、LZD、CFZ对MDR-TB具有很强的杀菌或抑菌活性,提示在MDR-TB治疗方案中引入这四种药可能会提高MDR-TB的治愈率。新型抗结核药是治疗MDR-TB的最后一道防线,但鉴于MDR-TB在未暴露于新药的前提下,仍有对BDQ和DLM耐药性的检出,尤其是对DLM呈现较高的耐药率,警示我们应用新药对患者进行治疗前,应该进行必要的药敏试验及时发现耐药性,以阻断耐药菌株的传播,延长新药使用的有效期。最后,我们采用全基因组测序（WGS）技术和TBProfiler平台,对该地区结核分枝杆菌的分子耐药特征和遗传多样性进行分析,同时结合MIC值,探讨耐药基因突变与耐药水平的关系,以期为我国耐药结核病分子诊断方法的研发和应用以及防控工作重点的确定提供参考。本研究共获得1407株结核分枝杆菌的WGS数据。研究结果发现,RIF耐药菌株的基因突变主要位于rpoB450、rpoB445及rpoB435密码子,占比达83.76%（98/117）;INH耐药菌株的突变位于katG 315密码子以及fabG1启动子区（80.10%,153/191）,katGSer315Thr为最常见的耐药突变（54.97%,105/191）;EMB 耐药菌株以 embB Met306Val（51.11%,23/43）和Met306Ile（16.28%,7/43）突变为主;SM耐药菌株以rpsL基因突变为主（76.00%,95/125）,rpsL Lys43Arg 为最常见的耐药突变,占比 62.40%（78/107）;gyrA94 和gyrA90突变（OFL:80.56%,58/72;MXF:70.73%,58/82）为 FQs 耐药的主要突变机制。rpoB450 突变、katG315 突变、rpsLK43R、gyrA D94X、rrs（a1401g）突变及组合突变导致菌株对相应的抗结核药物耐药水平较高,而rpoB452突变,fabG1（c-15）突变、katG non315突变导致的耐药水平较低。湖南省流行的结核分枝杆菌以 Lineage2（59.42%,836/1407）和 Lineage4（39.87%,561/1407）为主,五年内结核分枝杆菌的各种群结构比较稳定,构成比未随年份呈现趋势性变化（P>0.05）。Lineage2 对 INH（χ2=13.350,P<0.001）,RIF（χ2=17.690,P<0.001）,EMB（χ2=19.640,P<0.001）,SM（χ2=39.609,P<0.001）,OFL（χ2=5.587,P=0.018）,KAN（χ2=5.101,P=0.024）,RFB（χ2=17.106,P<0.001）的耐药率明显高于Lineage4,对其他抗结核药耐药率的差异无统计学差异（P>0.05）。同时,Lineage2中DR-TB（χ2=10.447,P<0.001）,MDR-TB（χ2=17.235,P<0.001）及 Pre-XDR-TB（χ2=12.959,P<0.001）的频率明显高于Lineage4,两组间XDR-TB率的差异无统计学意义（P=0.154）。遗传多样性与耐药相关性分析结果提示应加强对Lineage2菌株耐药性的监测,以防止耐药菌株的传播和扩散。总之,本研究有助于了解和掌握我国湖南省流行的结核分枝杆菌对常用一线、二线抗结核药的耐药率、耐药谱及耐药趋势等特征,对结核病防控和耐药监测工作重点具有一定参考作用。同时提供了相对匮乏的关于耐药突变与MICs相关的数据,为阐明基因型耐药与表型耐药的量化关系提供了线索,有利于新型诊断技术的开发和临床决策的指导。