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怀牛膝是一种非常适宜连作的道地性中药材，连作下牛膝产量和药用品质均有显著提高，为了全面了解怀牛膝连作对根际土壤微生物区系演变的作用效果，探讨怀牛膝连作促进的作用机理，本研究以连作两年怀牛膝根际土壤(2Y)、连作20年怀牛膝根际土壤(20Y)和空白对照土壤(CK)为试验材料，测定了土壤的基本理化性质，并联合运用Biolog微平板技术、磷脂脂肪酸(PLFA)技术和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术对根际土壤微生物群落结构和功能多样性做进一步研究，结果表明：怀牛膝连作对土壤基本理化性质产生显著影响：对比20Y土壤和2Y土壤，有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮（铵态氮）和速效磷均有所增加，尤其以全磷、速效氮（铵态氮）和速效磷增加较为显著。对比20Y土壤与对照CK土壤，20Y土壤的有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮（铵态氮）和速效磷分别是CK土壤的1.05、1.59、1.99、1.1、1.85和1.88倍，这说明怀牛膝连作一定程度上改善根际土壤环境，提高土壤的保肥能力和补给能力，不仅有利于植株的生长，还为根际微生物活动提供营养和能源。Biolog、PLFA和T-RFLP三种实验技术的结果分析表明，连作使得怀牛膝根际土壤微生物群落结构发生显著变化，而微生物多样性差异不显著。Biolog实验结果表明，不同连作年限的三种土壤样品其微生物群落对碳源底物的代谢活性存在明显差异，其中20Y土壤微生物对氨基酸类的代谢活性较高，对多聚物、酚酸类、羧酸类的代谢活性较低。通过PLFA实验从土壤中提取到28种PLFAs生物标记，发现2Y和20Y土壤中，细菌PLFA相对总量占绝对优势，占有率分别为51.12%和48.54%，真菌次之，PLFA相对含量占有率分别为26.6%和28.54%，原生动物和放线菌依次减少。但20Y土壤中，真菌、放线菌和原生动物的PLFA相对含量比2Y分别高出19.4%、1.4%和2.3%。T-RFLP技术采用HaeⅢ、MspI、AluI、AfaI四种限制性内切酶进行酶切，其中经AfaI酶切后，CK、2Y、20Y分别获得235、230和160个有效T-RF片段。与数据库比对后，发现一些有益菌（以芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属为主），包括枯草芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、假单胞菌属等和一些改善土壤质地，防治植物病害的功能菌（如链霉菌属等）随着连作年限的增加而不断增加，而以支原体属为主的病原菌则不断减少。综上，连作使得怀牛膝根际土壤微生物群落结构发生显著变化，但微生物多样性差异较不显著。随着怀牛膝种植年限的增加，一些有益菌和功能菌（有益真菌、放线菌、原始动物和芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属和链霉菌属等）不断富积，而一些病原菌（利用酚酸类代谢的有害菌、支原体属等）的数量则不断减少，这可能与长期连作下，怀牛膝根系分泌物的不断释放与累积有关。在根系分泌物的介导下，根际土壤微生物之间此消彼长，有益微生物之间互利协作，提高了根系的抗性水平，改善土壤肥力和补给能力，土壤微生物群落在不断的竞争中趋于一种动态平衡，调节着土壤微生态环境，促进土壤养分转化与植物吸收，从而促进怀牛膝的生长，提高牛膝的产量和品质。