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朊病毒病也称可传播海绵状脑病,是一组由朊病毒引起的致死性神经系统疾病。人朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)、Kuru病、GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome,GSS)和家族致死性失眠症(fatal familial insomnia,FFI)。根据病因学的特点,克雅氏病可分为散发型CJD(sporadic CJD, sCJ)、医源型CJD (iatrogenic CJD, iCJ)、家族遗传型CJD (genetic, gCJD)和变异型CJD (variant CJD, vCJD)。动物朊病毒病包括羊瘙痒病(scrapie)、牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和麇鹿慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。目前主流观点认为,朊病毒病的感染因子是细胞内正常朊蛋白发生错误折叠而转变成的具有自我复制能力的致病性朊蛋白。蛋白质巯基亚硝基化修饰是一种与蛋白质磷酸化方式类似的蛋白质翻译后修饰方式,即一氧化氮(nitric oxide, NO)与蛋白质半胱氨酸巯基发生反应生成巯亚硝基(-SNO)的过程。研究报道,NO通过蛋白质巯基亚硝基化修饰调控蛋白质的活性与功能,是一种氧化还原信号的转导机制。多种神经退行性疾病与机体的氧化还原状态关系密切,尤其是一些靶蛋白的亚硝基化修饰参与了神经变性疾病的发生、发展过程。目前,对不同类型人朊病毒病脑组织中潜在的亚硝基化修饰靶点尚缺乏较全面系统的研究。为此,本文开展了以下研究工作：利用正常仓鼠和羊瘙痒因子263K感染的仓鼠模型,采用生物素转化法,将朊病毒病脑组织中亚硝基化蛋白转化为生物素标记的蛋白,进而富集亚硝基化修饰的蛋白。我们对纯化方法的各个步骤进行了优化,包括生物素标记蛋白与链霉亲和素磁珠的混合比例、孵育温度和孵育时间及链霉亲和素磁珠洗脱缓冲液。结果如下：1、生物素标记的蛋白及链霉亲和素磁珠孵育比例为3：1、孵育温度和时间为25℃、120 min; 2、特异性洗脱缓冲液为0.5% SDS；3、利用上述优化条件,富集动物及人朊病毒病脑组织中(100 mg总蛋白)亚硝基化修饰蛋白至少需要12轮孵育过程。后续的Western blot和iTRAQ质谱分析技术证明上述分离纯化到的亚硝基化修饰蛋白保留有良好的免疫反应性,并可直接用于后续定量蛋白组学的研究。采用人朊病毒病病人sCJD(一例80岁男性)、FFI(一例48岁男性、一例26岁女性和一例55岁男性)、G114gCJD(一例47岁女性)及正常人(一位50岁男性、一位63岁男性和一位42岁女性)大脑及小脑组织,利用上述建立的技术方法富集了其大脑皮层及小脑组织中的亚硝基化蛋白。利用iTRAQ (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)标记技术结合纳升液相色谱、反相色谱串联质谱联用技术对上述蛋白进行分离鉴定并定量。在严格地质量控制体系下,我们获得的结果如下：1、在三种类型病人脑中共鉴定到1509个亚硝基化蛋白,其中三种病人小脑中共同拥有的亚硝基化蛋白有220个,大脑中共同拥有的亚硝基化蛋白有159个。2、利用Western blot技术验证了其中三种蛋白质的亚硝基化修饰形式在三种病人脑中的含量,结果与iTRAQ定量结果一致。3、GO功能注释分析表明,三种病人大脑及小脑组织中的上调亚硝基化蛋白主要参与物质代谢类、细胞骨架、细胞结构类及免疫系统类功能；而下调的亚硝基化修饰蛋白主要参与细胞骨架、细胞结构类、细胞间通讯类和多功能蛋白类。4、KEGG Pathway分析发现至少每两种病人脑中共有的细胞通路有系统性红斑狼疮途径、致病性大肠杆菌感染途径、细胞外基质受体的相互作用途径。5、利用蛋白互作网络分析软件,发现三种病人脑中亚硝基化修饰蛋白多集中于免疫系统、细胞骨架、细胞结构网络中。总之,我们以正常仓鼠和羊瘙痒因子263K感染的仓鼠为模型,建立了朊病毒病脑组织中亚硝基化蛋白纯化技术平台,该平台不仅适用于后续人朊病毒病脑组织中亚硝基化蛋白组学研究,而且对其它临床样本中亚硝基化蛋白组学研究具有重大借鉴意义。本研究第二部分利用高通量的iTRAQ技术联合质谱鉴定的蛋白质学策略,动态研究并筛选与朊病毒持续感染相关的蛋白,研究结果为探索朊病毒持续感染的分子机制研究及寻找特异性诊断和治疗朊病毒病的潜在标志物提供了新思路和理论依据。