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α-半乳糖苷酶也称蜜二糖酶,是催化α-半乳糖苷键水解的酶类,是一种在自然界中广泛存在的外切糖苷酶。其作用是催化α-半乳糖苷键的水解,即能水解非还原性末端以α键结合的半乳糖苷化合物,因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖,还能水解含有α-半乳糖苷键的杂多糖。现今对α-半乳糖苷酶的研究表明,该酶在饲料、制糖、食品、医药工业等领域具有广泛的应用前景。豆粕是目前应用最广泛的植物性蛋白饲料,但豆粕中含有一类α-半乳糖苷低聚糖抗营养因子,影响营养物质的吸收利用,如棉子糖,水苏糖等。α-半乳糖苷酶的应用方面使这类寡糖得以利用,同时可以通过减少抗营养因子来提高豆粕的利用率,消除胀气。实验表明,添加α-半乳糖苷酶可提高豆粕饲料有效代谢能8%、可消化蛋白7%。目前我国豆类饲料的年消耗约为1000万吨,广泛使用酶制剂后,相当于增加利用豆类达80万吨/年。因此开发α-半乳糖苷酶作为饲料添加剂,极富社会与经济价值。本实验以高产糖化酶的黑曲霉为受体菌,构建α-半乳糖苷酶黑曲霉表达载体,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选同源重组转化子,并对重组蛋白进行酶活检测以及SDS-PAGE分析,以其实现目的基因的高效表达。本实验的目的是利用本实验室构建的食品级黑曲霉表达载体分泌表达α-半乳糖苷酶,从而为α-半乳糖苷酶的工业化生产探索新的途径。主要研究结果如下:（1）α-半乳糖苷酶基因的克隆及表达载体的构建根据Genebank中黑曲霉α-半乳糖苷酶基因序列设计引物,从黑曲霉CICC2462中扩增得到α-半乳糖苷酶αglA和AglB。针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因（glaA）位点,利用基因置换技术,构建黑曲霉表达载体pSZHG-αglA和pSZHG-AglB。（2）黑曲霉农杆菌的转化及α-半乳糖苷酶同源重组转化子的筛选利用冻融法将农杆菌转化黑曲霉表达载体pSZHG-αglA转化到农杆菌AGL1中,通过农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化后,提取重组菌落DNA鉴定,并利用引物对转化子进行菌落PCR鉴定,得到3株阳性转化子。利用同源重组引物对分别鉴定出的3株阳性转化子进行PCR鉴定,结果3株阳性转化子均扩增出1701bp的目的条带,证明是同源重组转化子,pSZHG-αglA载体转化的同源重组率为100﹪。同理也将pSZHG-AglB成功转入农杆菌AGL1中。（3）α-半乳糖苷酶在重组菌株中表达分析在摇瓶发酵条件下,发酵液上清中的α-半乳糖苷酶活力最高可达到10.2 U·mL-1,是出发菌株的10.4倍。将酶活达到最高值的重组α-半乳糖苷酶发酵液上清进行SDS-PAGE检测,结果显示3重组菌株均成功分泌表达,明显高于出发菌株。结果表明,本研究实现了α-半乳糖苷酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级α-半乳糖苷酶的大规模工业化生产奠定了基础。