由弧菌引起的弧菌病对全球水产养殖业造成了巨大的危害。溶藻弧菌是严重危害我国南方水产养殖业的主要病原菌。实验室的前期工作鉴定了溶藻弧菌可能的毒力因子,包括胞外蛋白酶、运动性、铁载体介导的铁摄取系统以及胞外多糖等,对于溶藻弧菌毒力因子以及致病性调控机制的研究则主要集中在群体感应系统。群体感应系统广泛存在于细菌中,是细菌通过细胞密度依赖型的方式实现种内以及种间对话交流的一种信号转导途径,参与多种生理功能,并对多种病原菌的毒力和致病性具有重要的调控作用。本研究以分离于发病鱼体的溶藻弧菌菌株EPGS为研究对象鉴定出参与其群体感应系统的两个新的元件(Hfq和LuxT),并进一步研究了它们在溶藻弧菌群体感应系统中的位置和作用,以及对溶藻弧菌毒力的调控。本文鉴定了sRNA分子伴侣蛋白Hfq对溶藻弧菌多种生理功能及毒力的调控作用。通过构建Hfq无标记框内缺失突变株和回补菌株,发现Hfq对溶藻弧菌的运动性和生物被膜形成具有显著的激活作用,对胞外蛋白酶活性则起到抑制作用。利用溶藻弧菌主要胞外蛋白酶Asp抗体进行蛋白水平测定,显示Hfq对Asp生成具有抑制作用,且Hfq主要通过抑制群体感应中枢元件LuxR的表达来实现对Asp生成的调控。此外,Hfq对于溶藻弧菌响应外界环境压力具有重要的作用。Δhfq在43℃、10%乙醇、30%蔗糖、200μmol/L 2,2’-二联吡啶的LBS培养基中生长受到明显抑制。前期研究发现,RpoS对于溶藻弧菌在不同环境压力下的生长具有重要作用,因此通过将RpoS回补至Ahfq中检测环境应激能力,发现除了限铁条件外,Δhfq在其他环境压力下的生长均回复到野生型水平,表明Hfq通过对RpoS的激活作用实现对不同环境压力的响应。此外,通过对Δhfq生长能力和毒力的测定发现,Δhfq在鱼体内显著减毒,其半致死剂量为野生型的17倍。体内增殖结果显示,采用低剂量Δhfq感染斑马鱼体时,菌体不会增殖,很快被鱼体清除。采用高剂量Δhfq感染鱼体时,菌体虽然有增殖,但是最终被清除干净。采用高剂量野生型菌株感染鱼体时,菌体持续增殖,最终引起斑马鱼的大量死亡。这些结果表明,Hfq对于溶藻弧菌在斑马鱼体内的增殖起到至关重要的作用。鉴于Δhfq上述特性,分别以斑马鱼和石斑鱼为模型对其免疫保护率进行评估,实验结果表明Ahfq以注射给药的方式对斑马鱼和石斑鱼的免疫保护率均达到70%以上,当以浸泡给药的方式免疫石斑鱼时,免疫保护率亦能达到75%以上。这些实验结果表明Δhfq可以作为一种很好的减毒活疫苗候选株用于鱼类弧菌病的防治。本实验还鉴定了溶藻弧菌群体感应系统另一个新的组成元件LuxT。实验发现,LuxT的转录与表达受到细胞密度调控,并且受到群体感应系统上游元件LuxU的正调控作用。当三套信号分子合成途径同时受阻时,其转录水平明显下降,而当单独阻断其中任何一条信号分子合成途径时,LuxT的转录水平变化不明显。实验发现LuxT位于群体感应中枢元件LuxO-LuxR上游,并对luxO基因的转录具有显著的激活作用,LuxT可能通过与luxO启动子区直接结合实现调控。同时,LuxT对luxR基因的转录没有影响,对LuxR的表达具有转录后水平的激活作用。本实验建立了LuxT、LuxO和LuxR三者间不同于哈维氏弧菌、创伤弧菌以及鳗弧菌的独特调控网络模式。此外,虽然LuxT对于溶藻弧菌的运动性和胞外蛋白酶的产生具有正调控作用,但是在斑马鱼模型上进行毒力测定时,luxT基因框内缺失突变株与野生型的半致死剂量基本相同,没有明显的减毒效果。LuxT一方面通过激活LuxO的表达实现对LuxR表达的抑制,另一方面又通过未知元件实现对LuxR表达的转录后激活,最终实现对溶藻弧菌毒力的精细调控。本论文还构建了一套基于Gateway克隆技术的基因功能研究的质粒系统。传统的突变株及回补株构建方法都是利用限制性内切酶的酶切及连接反应来进行的,该方法依赖于限制性内切酶的酶切能力、质粒载体的稳定性、目的片段与质粒载体之间的连接效率等。传统克隆技术中质粒载体携带的限制性酶切位点的有限性和目的片段中含有的酶切位点的多样性之间的矛盾会为后续的克隆构建工作带来困扰。为了避免上述问题,本文改造了突变株及回补株构建过程中使用的质粒,使其可以利用Gateway克隆技术进行克隆构建工作。该技术利用位点特异性重组的原理,不需要限制性酶切消化即可实现目的片段与质粒载体的重组,反应时间短,重组效率高,大大简化了克隆过程,提高了筛选效率。利用改造后的Gateway兼容型质粒pDM4.DEST和pMMB206.DEST成功构建了溶藻弧菌T6SS中的5个组分的无标记框内缺失突变株及回补株,为系统研究这些基因的功能打下基础。