肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是引起手足口病的主要病原体之一,多感染5岁以下幼儿,主要通过亲密接触、呼吸道及消化道等途径传播,可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹和溃疡,个别患者可导致心肌炎、肺水肿以及无菌性脑膜炎等并发症甚至死亡。目前,国内市场还没有针对手足口病的治疗药物,只能采用对症支持治疗。理想的小动物模型的缺乏严重制约了手足口治疗药物的研制进程。目前,可用于EV71感染的动物模型有灵长类猕猴模型、乳鼠模型以及转基因小鼠模型,但以上模型都存在各自的缺陷,尚不能作为合适的疾病模型。有研究发现,EV71能够感染幼龄中缅树鼩,具有发展为理想动物模型的潜力,建立一个成熟、稳定的树鼩体外细胞感染模型,可为EV71感染树鼩模型的建立奠定基础并提供理论依据。本研究首先建立了EV71载量测定的方法,通过对比EV71 VP1基因序列,筛选出高度保守区域,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1+载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。经实验验证,引物和探针的最佳工作浓度分别为300nM和200nM,在1×103-1×109拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R2=1),灵敏度可达到102 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16 (Coxsackievirus A16, CA16)、柯萨奇B1 (Coxsackievirus B1, CB1)、人轮状病毒(Human rotavirus, HRV)、疱疹病毒(Herpesvirus, HSV)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。其次,用胰蛋白消化和机械振荡法联合使用,分离获得树鼩原代肾上皮细胞,用含5ng/mLEGF的RPMI1640完全培养基进行培养,并用角蛋白18抗体(Cytokeratin 18, CK18)对树鼩肾细胞进行鉴定,显微镜下观察大部分细胞都可发出绿色荧光,表明所分离出的细胞是肾上皮细胞。用MTT对树鼩肾细胞进行生长特性的测定,结果发现,在培养的1d-2d天内细胞生长速度缓慢,培养到3d-4d时细胞开始进入指数生长期,10d以后细胞生长进入平稳期,14d以后细胞开始凋亡。利用Vero细胞培养获得高毒力的EV71病毒,培养的病毒滴度可达5×107TCID50/mL。将培养的高毒力EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,通过RT-PCR定性和TaqMan荧光定量PCR检测病毒上清,结果发现RT-PCR可检测出目的条带,定量测定病毒载量可达106copies/μL,与EV71感染Vero后上清中病毒载量大小无显著性差异,表明EV71可以在树鼩肾细胞内复制增殖。通过测定EV71感染树鼩原代肾细胞后培养上清中病毒载量和滴度的变化,确定了该病毒在树鼩肾细胞中最适感染复数(Multiplicity of infection, MOI)为5,用最适的MOI将EV71接种到树鼩原代肾细胞中,发现在感染的第4d,上清中病毒滴度达到最大,可达5×105TCID50/mL,之后,随着时间的增加,病毒滴度开始下降。利用Western blot和间接免疫荧光方法对感染后的树鼩肾细胞进行EV71 VP1蛋白表达情况的检测,发现在感染后的第2d～6d均能检测到目的蛋白的表达。综上所述,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于后续EV71感染实验的载量测定。胰蛋白酶消化法与机械振荡法联合使用,分离获得的树鼩原代肾上皮细胞,经高滴度的EV71病毒感染后,通过核酸和蛋白水平检测,均证实树鼩原代肾细胞可以被EV71感染。该实验结果可为EV71感染树鼩动物模型的建立提供体外病毒易感性实验依据。