以Gefitinib为代表的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)广泛用于肿瘤生物靶向治疗。然而持续应用后难以回避的耐药是制约EGFR TKIs进一步应用的瓶颈。抑制糖酵解可以在多种肿瘤中诱导细胞死亡或恢复肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性。EGFR通路与肿瘤细胞代谢过程存在密切的相关性,抑制糖酵解提高了NSCLC细胞对EGFR TKIs的敏感程度。丙酮酸脱氢酶激酶同种型4(PDK4)通过阻断丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)的作用促进糖酵解过程,并且与多种肿瘤细胞的耐药与存活有关。转录因子FoxO3a可以调控包括代谢在内的多种细胞过程并发挥肿瘤抑制作用。在这里,我们探究在NSCLC细胞中FoxO3a通过调控糖酵解过程而逆转EGFR TKIs耐药性的机制,为临床解决EGFR TKIs耐药问题提供新的治疗策略和实验数据支持。目的通过体外细胞实验,采用重组质粒过表达基因和si RNA特异性沉默基因等分子生物学方法,研究了FoxO3a对PDK4和NSCLC中EGFR TKIs耐药的影响及作用机制,并探讨特异性抑制PDK4的新的治疗策略。方法1 MTT法检测细胞对Gefitinib的敏感性分别通过磷酸钙转染法和脂质体转染法向NSCLC细胞中转染重组质粒和si RNA,随后采用MTT法检测FoxO3a和PDK4表达变化前后NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性,绘制生长抑制曲线并计算IC50。2比色法检测FoxO3a对葡萄糖消耗与乳酸生成的影响分别通过磷酸钙转染法和脂质体转染法向NSCLC细胞中转染重组质粒和si RNA,随后采用比色法检测FoxO3a和PDK4表达变化前后NSCLC细胞消耗葡萄糖与生成乳酸的水平。3体外探究FoxO3a与PDK4的关系为了探究FoxO3a调控糖酵解的机制,在高表达和沉默FoxO3a后,通过Western blot和RT-PCR分别在蛋白水平和m RNA水平检测和糖酵解有关的蛋白PKM、LDHA、LDHB、PDK3、PDK4的表达。4非小细胞肺癌细胞中PDK4对细胞耐药的影响为了探究PDK4与非小细胞肺癌耐药的影响,我们通过MTT试验检测了高表达和沉默PDK4后细胞对Gefitinib的敏感性。5体外探究FoxO3a对PDK4的调控机制为了进一步探究FoxO3a作为转录因子调控PDK4的具体机制,我们首先通过NCBI数据库查出PDK4转录起始位点上游2000 bp长度的启动子区序列,再使用JASPAR CORE Vertebrata database预测FOXO3在PDK4启动子区域可能存在的的结合位点。并根据这些结合位点设计对应的RT-PCR引物用于检测染色质免疫共沉淀实验结果,进而证明FoxO3a是否通过直接与PDK4启动子区域结合而发挥转录调控作用。结果1非小细胞肺癌细胞系中FoxO3a、细胞耐药及糖代谢的变化PC9细胞对于Gefitinib敏感,IC50为1.137±0.021 n M;H1975和H1299细胞对于Gefitinib有一定抗性,IC50分别为2184.711±95.286 n M和15474.795±420.671 n M,P<0.0001。H1975和H1299细胞中FoxO3a的蛋白及m RNA表达水平均显著低于PC9细胞中FoxO3a的水平(蛋白水平P<0.0001H1299 v.s.PC9,P=0.0092 H1975 v.s.PC9;m RNA水平P<0.0001 v.s.PC9)。在耐药细胞株H1975和H1299中,相较于敏感细胞株PC9(葡萄糖消耗为15.454±0.041m M,乳酸生成为2.317±0.006 m M),葡萄糖的消耗(分别为16.838±0.060 m M和17.000±0.053 m M,P<0.0001)与乳酸的生成(分别为3.178±0.025 m M和3.818±0.003 m M,P<0.0001)均增加。2非小细胞肺癌细胞系中FoxO3a与细胞耐药及糖代谢有关高表达FoxO3a后,PC9细胞对Gefitinib的IC50减小为0.566±0.009 n M(P<0.0001),葡萄糖的消耗与乳酸的生成也减少,分别为11.931±0.024 m M(P<0.0001)和1.924±0.004 m M(P<0.0001);H1975细胞对Gefitinib的IC50也减小,为407.889±2.696 n M(P<0.0001),葡萄糖的消耗与乳酸的生成也减少,分别为14.272±0.048 m M(P<0.0001)和2.722±0.018 m M(P<0.0001)。沉默FoxO3a后,PC9细胞对Gefitinib的IC50增大为4.061±0.046 n M(P<0.0001),葡萄糖的消耗与乳酸的生成也增加,分别为18.131±0.060 m M(P<0.0001)和2.878±0.009 m M(P<0.0001);H1975细胞对Gefitinib的IC50也增大,为5091.710±57.514 n M(P<0.0001),葡萄糖的消耗与乳酸的生成也增加,分别为17.562±0.215 m M(P=0.0049)和3.337±0.007 m M(P<0.0001)。3 PC9细胞中FoxO3a对糖酵解有关基因的影响在蛋白及m RNA水平,FoxO3a对PKM、PDK4有明显的抑制作用,而对LDHA、LDHB、PDK3无明显影响。4非小细胞肺癌细胞中PDK4对细胞耐药的影响高表达PDK4后,PC9细胞对Gefitinib的IC50增加为9.735±0.223 n M(P<0.0001),H1975细胞对Gefitinib的IC50也增加为3985.821±157.505 n M(P<0.0001)。沉默PDK4后,PC9细胞对Gefitinib的IC50减小为0.284±0.008 n M(P<0.0001),H1975细胞对Gefitinib的IC50也减小为923.185±14.672 n M(P<0.0001)。5 FoxO3a通过影响转录抑制PDK4从而抑制糖酵解比较FoxO3a组中各结合位点富集效率的倍数,我们发现在GTGAACAA结合位点处的富集倍数为5.213倍,差异具有统计学意义。FoxO3a可能通过直接结合PDK4启动子区域的5’-GTGAACAA-3’序列而发挥对PDK4的抑制作用。结论1.FoxO3a在对Gefitinib敏感的NSCLC细胞中高表达,PDK4在对Gefitinib耐药的NSCLC细胞中高表达。2.FoxO3a增强了NSCLC细胞对Gefitinib的敏感性。3.FoxO3a可以抑制NSCLC细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生。4.FoxO3a可能通过直接结合PDK4启动子区域的5’-GTGAACAA-3’序列而发挥对PDK4的抑制作用。