类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性关节骨、软骨破坏为主要特征。目前，RA的病因及发病机制仍尚未清楚，但越来越多的研究发现天然免疫在RA的发病和病情进展中起重要作用。Toll-like receptors(TLRs)是一组介导天然免疫反应的受体分子，它通过识别病原相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs)及某些内源性配体，引发信号转导并导致炎症介质的释放，最终激活获得性免疫。迄今为止，人类已发现11个Toll样受体家族成员(TLR1-11)，其中，TLR2被认为与RA发病关系最为密切。TLR2的高表达是导致RA炎症反应和病情加重的因素之一，但其具体表达调控机制尚不明确。　　流行病学调查显示，RA在女性发病多于男性，特别是在55岁以下的RA患者中，女性的发病率明显高于男性，是男性的4～5倍。同时女性患者病情的严重程度受妊娠、分娩以及月经周期的影响。已有研究表明，雌激素在RA的发病中可能起着很重要的作用。　　雌激素和TLR2都是与RA发病相关的重要因子，但是，迄今尚无有关雌激素对TLR2基因表达调控作用的报道。本研究以17β-雌二醇(E2)为刺激因素，探讨在体外类风湿性关节炎细胞模型中，雌激素对TLR2基因表达的影响及其作用机制，这不仅对深入了解TLR2基因功能有重要意义，而且将为阐明RA的发病机制提供重要的分子水平依据。　　材料与方法：　　一、实验材料　　1、人淋巴瘤白血病单核细胞系THP-1，人胚肾细胞系HEK293;　　2、刺激药物:E2、PMA、IL-1β、ICI182，780、放线菌素D(actinomycin-D)和放线菌酮(cycloheximide);　　3、RNA提取相关试剂、RT试剂盒及Real-time PCR相关试剂;　　4、人类雌激素受体alpha(ERα)表达载体;　　5、Western印迹杂交相关试剂　　6、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂　　7、电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂　　二、实验方法　　1、炎性细胞模型的建立;　　2、Real-time PCR检测E2等药物刺激前后TLR2 mRNA表达水平的变化;　　3、Western blot检测E2对TLR2蛋白表达水平的影响;　　4、构建荧光素酶报告基因载体p403-1uc，转染HEK293细胞，双荧光素酶活性检测系统分析HEK293细胞中单独转染ERa，或单独E2刺激，或转染ERa同时以不同浓度E2刺激对TLR2基因启动子活性的影响;　　5、利用生物信息学软件分析TLR2基因启动子结构，构建TLR2启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性;　　6、双荧光素酶活性检测系统分析E2刺激前后TLR2启动子活性的变化，鉴定TLR2启动子关键的转录调控区和雌激素反应区;　　7、EMSA实验鉴定TLR2启动子内激素反应元件及E2对ERa与该反应元件结合力的影响;　　8、ChIP实验进一步在体内条件下验证ERa与该位点的结合以及E2对这种结合的作用。　　结果：　　1、Real-time RT-PCR结果证明E2以浓度依赖方式上调TLR2 mRNA表达水平。　　2、Western印迹杂交显示E2使THP-1细胞中TLR2蛋白水平显著增加。　　3、Real-time RT-PCR结果显示雌激素受体抑制剂ICI182，780和转录抑制剂actinomycin-D可分别抑制这种上调，而蛋白合成抑制剂cycloheximide则否。　　4、TLR2基因启动子报告基因p403-1uc转染HEK293细胞，荧光素酶活性分析显示E2呈ERa依赖和剂量依赖方式上调启动子活性。　　5、生物信息学分析显示TLR2基因启动子区无TATA盒，存在ER、Sp(l)、AP-2a、及C/EBP等多个潜在的转录因子作用元件;　　6、系列截短的TLR2基因启动子报告基因荧光素酶活性分析提示-287～-230区域是该基因的雌激素反应区;　　7、EMSA和ChIP实验分别在体外和体内条件下证明了TLR2启动子-251～-237区存在ER反应元件;并且E2作用增强ER蛋白与这个位点的结合。　　结论：　　1、E2刺激可以上调TLR2基因mRNA和蛋白表达水平;　　2、TLR2基因启动子-251～-237区域存在ER反应元件;　　3、在类风湿性关节炎细胞模型中，雌激素受体反应元件介导雌激素对TLR2基因表达水平的上调。