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miRNA广泛在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的生长发育和卵巢的功能具有关键调控作用。众多研究表明,miR-101与miR-144调控多种细胞的生长、分化和凋亡。但是目前尚未有miR-101与miR-144调控奶山羊卵巢颗粒细胞的研究。本研究以关中奶山羊为研究对象,采用生物信息学预测和双荧光素酶报告载体构建等方法验证miR-101与miR-144的靶基因;采用RT-q PCR、Western blot检测技术研究miR-101与miR-144对靶基因TGIF1的调控作用;采用流式细胞术等方法研究miR-101与miR-144对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用机制;以期阐明miR-101与miR-144调控卵巢颗粒细胞的作用机制,为提高奶山羊产羔率提供试验依据。主要研究结果如下:1、在奶山羊卵巢颗粒细胞中,验证miR-101、miR-144与TGIF1基因的靶向调节关系(1)利用生物信息学软件预测了TGIF1基因3′UTR区含有miR-101和miR-144的靶位点。构建双荧光素酶报告载体,分别将miR-101和miR-144的模拟物以及Negative control(NC)与TGIF1-3′UTR区双荧光素酶报告载体共转染到293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,与NC组相比,miR-101和miR-144分别显著抑制荧光素酶活性。而将NC、miR-101和miR-144的模拟物与突变载体共转染,检测荧光素酶活性。结果显示,与NC组相比,miR-101和miR-144对突变载体的荧光素酶活性没有显著影响。据此初步鉴定TGIF1基因为miR-101和miR-144的靶基因。(2)采用RT-q PCR和Western blot技术检测miR-101和miR-144对靶基因TGIF1的表达调控,同时检测TGIF1基因在山羊组织中的表达情况。分别将NC、miR-101和miR-144的模拟物以及抑制剂转染至奶山羊卵巢颗粒细胞中,结果显示,与NC组相比,miR-101和miR-144分别显著下调靶基因TGIF1在m RNA和蛋白水平上的表达;而转染miR-101和miR-144的抑制剂之后,显著上调TGIF1基因在m RNA和蛋白水平上的表达。同时根据RT-q PCR的检测结果,显示在奶山羊的子宫、卵巢和乳腺中,TGIF1基因的表达相对较高。2、研究miR-101与miR-144对奶山羊卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用机制(1)采用流式细胞术检测miR-101与miR-144对奶山羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响,结果表明,与NC组相比,过表达miR-101与miR-144使颗粒细胞的凋亡率显著升高。(2)采用Western blot技术检测Bcl-2、Bax和p53等凋亡基因的蛋白表达,结果表明,与NC组相比,miR-101和miR-144显著下调Bcl-2和Bax凋亡基因的蛋白表达,显著降低Bcl-2/Bax的蛋白比值;与NC组相比,miR-101和miR-144显著上调p53磷酸化水平。以上结果表明,TGIF1基因在奶山羊的子宫、卵巢和乳腺中的表达相对较高;在奶山羊卵巢颗粒细胞中,miR-101与miR-144负调控靶基因TGIF1;miR-101与miR-144可能通过下调Bcl-2/Bax的比值,上调p53磷酸化水平来促进颗粒细胞的凋亡。