目的：异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)作为多种血液系统恶性疾病唯一的治愈手段,已经越来越广泛地应用于临床。aGVHD及其治疗相关的感染是引起患者非复发死亡率升高的重要原因。Ⅱ-Ⅳ度aGVHD在allo-HSCT后的中位发生率为40%(10%-80%),其中约30%-60%的患者进展为糖皮质激素耐药重度(Ⅲ-Ⅳ度)aGVHD。目前,国际上针对糖皮质激素耐药重度aGVHD治疗尚无标准的推荐方案,仅10%-30%能获得完全缓解及长期生存。T细胞是造血干细胞移植后介导aGVHD的主要细胞,其不同亚群在移植后发挥了不同的作用。探讨关键T淋巴细胞及其相关细胞因子在aGVHD发生、发展过程中的的作用机制成为目前aGVHD研究的热点之一。本研究通过对本中心近5年来亲缘全相合供者(MSD allo-HSCT)、无关供者(URD allo-HSCT)、亲缘半相合供者(HRD allo-HSCT)移植后aGVHD的预防措施、发生特点、移植临床疗效的观察,探讨预防和治疗aGVHD的临床经验。对于糖皮质激素耐药的重度aGVHD,通过联合使用二线抗GVHD药物CD25单克隆抗体及肿瘤坏死因子(TNF-α)受体-抗体融合蛋白,观察治疗的安全性和有效性。进一步对allo-HSCT后患者免疫重建过程中,关键T淋巴细胞亚群及相关细胞因子进行监测,探讨移植后T细胞亚群免疫重建过程中的特征及其与aGVHD之间的关系,籍此期望建立aGVHD早期诊断的生物学指标,并进一步为aGVHD治疗寻找免疫治疗的重要靶点,最终实现降低移植患者的aGVHD相关死亡率,提高长期无病生存率。第一部分异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的预防与治疗研究方法：我们对2008年3月至2013年3月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的305例患者进行研究,其中包括亲缘HLA全相合移植(MSD-HSCT)、无关供者移植(URD-HSCT)和亲缘半相合移植(HRD-HSCT)三种移植类型。观察分析aGVHD的预防措施、发生特点、移植临床疗效等；进一步探讨aGVHD预防和治疗的临床经验；总结患者移植后aGVHD发病特点及移植治疗现状。用Kaplan-Meier曲线表示患者的累计aGVHD发生率、总生存率(OS)、无病生存率(DFS),单因素及多因素分析综合判断aGVHD发生的相关危险因素。结果：305例患者,男性177人,女性128人。其中MSD-HSCT患者90例,URD-HSCT患者116例,HRD-HSCT患者99例。所有患者中性粒细胞植入在MSD、 URD、HRD三组的中位时间分别为12天(7-17天)、12天(8-19天)、12天(8-24天),血小板植入中位时间分别为12天(7-58天)、13天(6-24天)、15天(6-53天)。MSD组Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生为15.6%,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD5.6%; URD组Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生为39.7%,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD12.9%; HRD组Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生为42.4%,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD17.2%、MSD、URD、HRD三组存活移植患者的中位随访期分别为27月(5-54月)、31月(5-53.5月)、27月(5.5-52.5月)。5年OS在MSD、URD、 HRD三组分别是77.2%,63.5%和60.8%；5年的DFS在MSD、URD、HRD三组分别是63.6%,58.4%和58.3%。多因素分析显示供者类型(URD及HRD)、女性供者供给男性受者移植是导致Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生率增加的独立危险因素。结论：MSD、URD及HRD-HSCT三种移植类型中,MSD-HSCT患者aGVHD的发生率最低,URD与HRD-HSCT患者的aGVHD发生率相似。MSD-HSCT患者5年OS显著优于HRD-HSCT患者,但与URD-HSCT患者相似。URD-HSCT与HRD-HSCT患者5年OS相似。5年的DFS在MSD、URD、HRD-HSCT三组中比较无统计学差异。多因素分析显示,供者类型、女性供者供给男性受者移植是导致Ⅱ-Ⅳ度aGVHD发生率增加的独立危险因素。MSD、URD及HRD-HSCT三种不同移植方案最终的临床疗效(DFS)一致,三种移植方案均可以作为血液系统恶性疾病患者接受造血干细胞移植时的一线治疗选择。第二部分糖皮质激素耐药重度急性移植物抗宿主病的治疗研究方法：我们对本中心2001年9月至2013年10月异基因造血干细胞移植后确诊糖皮质激素耐药重度(Ⅲ-Ⅳ度)aGVHD的56例患者进行了回顾性研究。2001年9月至2009年9月期间的27例患者采用传统二线抗aGVHD治疗方案,如较大剂量甲强龙针剂2-5mg/kg/d、CD3单克隆抗体、布地奈德、FK506、MTX、单用CD25单克隆抗体、单用肿瘤坏死因子(TNF-α)受体-抗体融合蛋白、血浆置换术等(对照研究组)。2009年10月至2013年10月的29例患者采用CD25单克隆抗体联合肿瘤坏死因子(TNF-α)受体-抗体融合蛋白双靶点方案治疗糖皮质激素耐药重度aGVHD(联合治疗组)。进一步评估联合用药组双靶点治疗方案的安全性和有效性。用Kaplan-Meier曲线表示患者的移植相关死亡率(TRM)、总生存率(OS)、无病生存率(DFS)、原发疾病复发率等。结果：56例糖皮质激素耐药重度aGVHD患者均达到造血重建,移植后3-4周造血干细胞植入证据检测(STR)均提示完全供者嵌合状态。联合治疗组患者中26例(89.7%)治疗有效,其中23例(79.3%)患者获得aGVHD症状的完全缓解(CR)。16例(55.2%)患者至今无血液病生存,中位存活时间21.5月(6-51月)。1年和4年OS分别为60.8%和51.0%。1年和4年DFS同样为60.8%和51.0%。对照研究组患者中12例(44.4%)治疗有效,其中8例(29.6%)患者获得CR。4例(14.8%)患者至今无血液病生存,中位存活时间67.5月(62-68月)。1年和4年OS分别为25.9%和14.8%。1年和4年DFS分别为22.2%和11.1%。结论：本研究创新性采用肿瘤坏死因子(TNF-α)受体-抗体融合蛋白联合CD25单克隆抗体双靶点治疗重度难治性aGVHD.该治疗方案耐受性良好,安全有效,显著提高了重度aGVHD的治愈率,有效降低了移植相关死亡率,同时不增加原发血液系统疾病的复发率。早期积极使用该二线治疗方案能进一步提高移植患者长期生存率及无病生存率。第三部分急性移植物抗宿主病中关键T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的研究方法：2013年5月至2014年1月,64例患者进入临床研究。患者在allo-HSCT后每周采血1次,持续3-6次或者至患者出院结束采集。使用流式细胞技术检测Treg、Th1和Th17细胞数目；使用流式细胞CBA技术检测患者血清中IL-2、IL-6、 IL-10、IL-17、TNF-a及IFN-γ水平；使用Elisa技术检测血清中TGF-p水平。结果：64名患者进入随访,36例(56.3%)发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD,其中10例(15.6%)发生Ⅲ-Ⅳ度aGVHD。aGVHD患者在发生aGVHD之前与未发生GVHD患者的细胞因子血清水平以及Treg、Th1、Th17细胞绝对值无统计学差异。aGVHD患者的IL-2(P=0.0231)、IL-10(P=0.0089)、TGF-β(P=0.0138)血清水平在aGVHD发生后早期显著高于无aGVHD患者。aGVHD患者在发生aGVHD后早期Treg细胞数量显著低于无aGVHD患者(P=0.0150)。对aGVHD患者发生aGVHD前后的上述细胞因子进行自身对照,发现IL-2、TGF-β血清水平在aGVHD发生后早期即较aGVHD发生前有明显的升高(P=0.0417,P=0.0168)；而IL-10血清水平也有升高趋势(P=0.0697)。对移植患者IL-2、IL-10、TGF-β血清水平及Treg细胞绝对值和aGVHD发生的关系进行ROC分析,并进一步进行logistic回归分析。结果表明,IL-2、IL-10及Treg细胞水平三者的线性组合是判断aGVHD发生的理想模型,其线性公式为：1.656+0.103x IL-2-0.052x IL-10-0.037x Treg.该线性组合的ROC曲线下面积为0.89(95%CI,0.78-0.99,P=0.0002),大于上述任意单一指标的曲线下面积。结论：移植患者血清IL-2、IL-10、TGF-β水平的升高对aGVHD早期临床诊断的确立能提供帮助,并有望为临床提供进一步免疫靶向治疗的依据。Treg细胞作为一种免疫调节细胞,在aGVHD发生的早期比例代表了总体免疫抑制的强度,其水平和aGVHD的发生呈负相关。IL-2、IL-10及Treg细胞水平三者的线性组合是判断aGVHD发生的理想模型,能够为aGVHD的早期诊断提供较为可靠的依据。