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川皮苷,橙皮素和桔皮素都属于黄酮类化合物,具有增强人体免疫力、抗癌、抑菌消炎、预防糖尿病和心脑血管疾病等多种药理功能和生理活性,已经广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好地确定了的特性值,用以校准设备、评价测量方法或给材料赋值的材料或物资。但是目前我国相关的类黄酮标准物质数量少、种类单一,相关标准物质制备与定值技术水平还有待提高。本文开展了川皮苷、橙皮素和桔皮素三种类黄酮纯度标准物质的研制,将为相关柑橘产品如保健品、化妆品和医药产品的质量监控提供技术支撑。实验以市售原料为实验材料,采用反相硅胶纯化法对橙皮素和桔皮素进行了纯化。按照标准物质技术规范的要求,分别采用质谱法(MS)、核磁共振氢谱法(~1HNMR)或红外光谱法(IR)进行定性分析;卡尔费休库仑滴定-直接进样法测定川皮苷、橙皮素及桔皮素中的水分;微波消解-电感耦合等离子体质谱法(Microwave-assisted ICP-MS)和微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法(Microwave-assisted ICP-OES)进行无机元素的含量测定;顶空进样气相色谱法测定有机挥发性杂质的含量;采用高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振氢谱法(~1H-NMR)以及示差量热扫描法(DSC)进行纯度定值分析;高效液相色谱法(HPLC)进行均匀性检验和稳定性考察。本研究的主要成果:1.采用柱层析法对市售的橙皮素和桔皮素等原药进行了纯化。分别建立了橙皮素和桔皮素原药的最优提纯方法。橙皮素样品的纯度由原药的98.66%提升至99.87%以上,桔皮素样品的纯度由原药的98.29%提升至99.98%以上,均满足国家二级纯度标准物质的纯度要求。根据建立的纯化方法进行了多次重复实验,得到了大量纯化后的产品,为橙皮素和桔皮素标准物质的研制提供了物质保障。同时采用质谱法、核磁共振氢谱法或红外光谱法对研制的三种类黄酮做了定性的确证。2.川皮苷和橙皮素分别采用了高效液相面积归一化法和定量核磁法两种不同的定值方法定值。优化了高效液相色谱定量分析的条件,通过对色谱柱,检测波长,样品浓度,流动相比例及洗脱方式的选择优化,建立了川皮苷和橙皮素的液相定量分析方法。川皮苷高效液相色谱定量分析的条件为:色谱柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5.0μm);流动相:0.2%乙酸水溶液:乙腈=60:40;流速:1.0mL/min;进样量:10μL;UV检测波长:334 nm;进样浓度:300 mg/L;柱温:25℃。橙皮素高效液相色谱定量分析的条件为:色谱柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5.0μm);流动相:0.2%乙酸水溶液:甲醇=45:55;检测波长:287 nm;进样浓度:300μg/mL;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL。川皮苷和橙皮素采用定量核磁法定值时,均采用DMSO-d6为溶剂,国家一级标准物质苯甲酸为内标物。川皮苷采用高效液相面积归一化法和定量核磁氢谱法两种定值方法的结果分别为99.58%,99.28%,取平均值,最终定值结果为99.43%。橙皮素采用高效液相面积归一化法和定量核磁氢谱法两种定值方法的结果分别为99.62%,99.60%,取平均值,最终定值结果为99.61%。川皮苷和橙皮素标准物质均获得了国家二级标准物质证书,证书编号分别为GBW(E)100456和GBW(E)100457。3.桔皮素采用高效液相面积归一化法和示差扫描量热法两种不同的定值方法定值。通过优化高效液相色谱定量分析的条件,建立了桔皮素高效液相色谱定量分析方法。桔皮素定量分析条件为:色谱柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5.0μm);流动相:0.2%乙酸水溶液:乙腈=45:55;检测波长:375 nm;进样浓度:1000 mg/L;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL。示差扫描量热法(DSC)的温度升温程序为:从148℃升温至158℃,升温速率0.5℃/min。桔皮素采用高效液相面积归一化法和示差扫描量热法两种定值方法的结果为99.81%和99.82%,取平均值,得到桔皮素标准物质的纯度为99.82%。4.采用已经优化好的HPLC条件对川皮苷、橙皮素和桔皮素进行均匀性及稳定性的检验。均匀性测量的数据采用单因素方差分析法(F检验)进行统计检验。采用趋势分析(T检验)对长期稳定性和短期稳定性的测量数据进行考察。结果表明川皮苷和橙皮素纯度标准物质6个月的长期稳定性良好,桔皮素纯度标准物质12个月的长期稳定性良好,三种类黄酮纯度标准物质在20℃、40℃、60℃的模拟运输温度、9天的运输时间条件下特性量值稳定。最终确定了研制出的川皮苷纯度标准物质的质量分数为99.4%,扩展不确定度为0.4%。橙皮素纯度标准物质的质量分数为99.6%,扩展不确定度为0.4%。桔皮素纯度标准物质的质量分数为99.8%,扩展不确定度为0.2%。