第一部分极重度感音神经性聋儿童的人工耳蜗植入术前评估及致聋危险因素分析研究目的：对极重度感音神经性聋患儿进行术前全面评估以确保人工耳蜗植入适应证的正确选择及其术后康复效果；了解环境和遗传因素在我国接受人工耳蜗植入群体中的比例。初步探讨湖南地区极重度感音神经性聋患儿的病因,为制定耳聋的预防计划提供理论依据。研究方法：本研究对2005年11月至2011年4月到我院及湖南郴州湘南学院申请行人工耳蜗植入的386例极重度感音神经性耳聋患者进行了回顾性调查,并进行系统的全身体格检查,听力学检查及影像学检查等,进行术前全面评估。对已知的耳聋的危险因素在聋儿的分布情况进行初步的探讨,并对较常见的一些因素进行多因素分析。研究结果：1、我们的研究对象确诊时间较晚,聋儿的平均疑诊时间接近2岁左右,确诊时间接近3岁。本研究中,386例耳聋儿童均存在言语障碍,仅有1例为语后聋。经听力筛查发现仅43例,因家人发现小儿听力差而就诊343例,说明尚有较多小儿未接受听力筛查。在接受人工耳蜗植入术前,386例聋儿中有231例验配助听器。2、386例聋儿含已知的危险因素共162人次,涉及114个聋儿,272人未查及已知的危险因素,占70.5%：有耳聋家族史21人次；围产期危险因素共88人次；产前危险因素共11人次；产后获得性危险因素共45人次。经统计分析可知耳毒性药物、家族史、缺氧、发育畸形、发热抽搐及中耳炎可能引起和促进极重度感音神经性耳聋的发生。而对危险因素的多因素分析表明,内耳畸形(大前庭水管综合症,Mondini畸形,小耳蜗畸形及共同腔畸形)是最主要的危险因素。结论：1、在整个人工耳蜗植入过程中,术前患者的综合评估是至关重要和必不可少的环节,其主要目的是从医学、听力学等多方面综合评价和决定患者是否适合实施人工耳蜗植入手术。2、本研究证实了遗传因素为极重度感音神经性聋儿的主要危险因素。对广大人群普及自我保健及防聋治聋知识,加强孕前、产前致畸因素的预防,预防及早期根治婴幼儿期的中耳炎及发热疾病；尽可能排除存在基因突变的遗传学因素。进行新生儿或儿童高危因素登记,对高危人群进行听力学筛查和随诊,并尽早干预,规范药物使用,将有助于减少极重度耳聋的发生。研究目的：对我国接受人工耳蜗植入群体进行分子病因学研究；重点探讨在接受人工耳蜗植入的病人中,GJB2, SLC26A4、线粒体12S rRNA基因突变发生的概率、突变形式和突变热点,探讨适合中国人极重度感音神经性聋的基因诊断策略。研究大前庭水管综合征(Enlarged vestibular aqueduct syndrome, EVAS)在中国人极重度感音神经性聋患者中的基因型和分子流行病学特点。比较基因芯片法和传统测序法在基因诊断中的优势及差异。研究方法：采集236名接受和申请人工耳蜗植入的重度及极重度感音神经性耳聋患者,30例EVAS患者和100例听力检测正常者的外周血。提取基因组DNA,用耳聋基因芯片检测四个国人中常见的耳聋相关基因中的9个热点突变,包括GJB2(35delG,176del16bp,235delC及299delAT),GJB3(538C＞T),SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和线粒体12S rRNA(1494C>T及1555A>G)。然后用传统测序法对基因芯片检测结果行验证,即对GJB2的编码区,DNA12S rRNA (1494C＞T及1555A>G)和SLC26A4基因的第7和8外显子,19号外显子进行测序。SLC26A4基因有21个外显子,完全检测较困难。为了进一步明确致聋原因,我们对基因芯片检测未发现突变或发现单杂合突变的大前庭水管综合征患者进一步行SLC26A4基因的DNA测序,先筛查第10、17、15、3外显子,然后筛查剩余外显子,直至发现另一个突变或筛查完全部SLC26A4外显子。研究结果：经测序,发现236例患者中93例携带有GJB2基因突变,发生率约35.36%。除3例纯合235deIC被判读为杂合外,测序方法同应用基因芯片检测的结果的结果一致,基因芯片的阳性突变检出率为21.19%(50例)。两种方法在阳性病人检出率间有统计学差异。而两种方法对GJB2基因相关性耳聋(纯合或复合杂合)的确诊率为23.31%(55/236)和16.10%(38/236),也有显著统计学意义。236例患者GJB2致病等位基因频率合计为31.36%(148/472),共发现15种突变类型：5种常见多态性；8种已报道的致病突变；和2种新突变类型。而其中235delC是最常见的致病突变类型,等位基因频率为15.5%(75/472),其次为109G>A,等位基因频率为10.8%(51/475)。新突变52A>C,511-512insAACGC,各有一例以复合杂合的形式出现。在非综合症耳聋患者检出一例223C>T——之前被认为引起综合症性耳聋的突变。非综合征型耳聋组40.55%(88/217)患者发现GJB2基因致病突变。而内耳畸形组的GJB2基因等位基因突变率13.16%(5/38),与正常听力对照无显著差异,说明GJB2基因突变不是内耳畸形的主要病因,但也可能是重要致病影响因素,对其他的致病基因产生协同或叠加的作用。本研究发现236例患者12S rRNA致病基因1494C>T及1555A>G检出率为分别为0.4%(1/236)及3.0%(7/236)。未发现GJB3(538C>T)患者。而在236名极重度感音神经性聋患者中,有21例(8.9%)检测出SLC26A4基因异常,其基因型包括IVS7-2A>G纯合1例,IVS7-2A>G/2168A>G (H723R)复合杂合4例,IVS7-2A>G单纯杂合16例。30例EVAS患者组中,基因芯片方法共检出SLC26A4基因突变25例,检出率为83.33%。而传统测序法中有28例患者检测出了SLC26A4基因突变,检出率为93.33%,与基因芯片法比较,检出率的差异无统计学意义。在本实验中(包括CI组及EVAS组),我们共发现了16种突变类型,其中5种为新的突变类型(A227P, G368X, IVS8-1G> T, IVS13+9C＞T和Q696X)。在所有的突变中,IVS7-2A>G突变的发生率最高,其次为H723R和T410M。结论：耳聋基因芯片对GJB2(35delG,176del16bp,235delC及299delAT) SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和线粒体12S rRNA1555A>G检出率高,能够适用于一般的基因筛查。但对12S rRNA1494C＞T,GJB3(538C＞T)检出率低,与适用人群有关。根据基因芯片快速检测后结果,并结合患者的临床资料,并对相应基因进行测序验证或全序列分析才能很好地将基因芯片的快速、经济、高通量的优势与测序的高准确性和高检出率的优势相结合。第三部分湖南苗族、土家族和汉族常见致聋基因的遗传流行病学调查研究目的：遗传性耳聋具有高度的遗传异质性,不同的地区和人群中耳聋基因的突变频率、突变方式和突变热点有很大的差异。目前GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体DNA12SrRNA基因等常见耳聋基因在我国人群中的流行分布情况被广泛研究,并取得了很大进展,研究主要在汉族人群中进行的,在少数民族耳聋人群中的耳聋基因分子流行病学研究较少。在本研究中,我们对湖南湘西少数民族地区的三个民族进行常见耳聋基因的分子流行病学研究,以了解耳聋基因在我国少数民族地区和少数民族人群的流行分布情况,明确相应突变谱和热点突变,为聋病基因的大规模筛查提供依据。研究方法：本研究用基因芯片与传统测序方法联合,在湖南湘西自治区汉族、苗族和土家族141例感音神经性耳聋患者中进行GJB2基因,线粒体DNA12S rRNA A1555G和SLC26A4基因突变分子流行病学调查,主要研究三个常见致聋突变在不同民族中携带率的差异。研究结果：在湖南地区正常听力人群中检测表明,苗族,土家族及汉族的GIB2基因突变等位基因频率为苗族最高,汉族最低,土家族与汉族、苗族与汉族均具有显著差别。三个民族间GJB2基因突变携带率无统计学差异。三个民族的GJB2基因突变均以V37I,235de1C为主。未检测出35de1G。提示湖南土家族和苗族的GJB2基因多态性分布与我国汉族相似,再次证实了三个民族有共同的人类种族起源。但在苗族和土家族正常听力人群中V37I突变的等位基因频率与携带率均较235de1C高,与汉族正好相反。GJB2基因突变在各民族耳聋患者中有较高的携带率,土家族GIB2基因突变携带率及等位基因突变频率均显著性低于汉族患者。235de1C突变是每个民族最常见的突变方式,其次为V37I。235de1C与V37I突变携带率及等位基因突变频率在土家族最低,但三民族间无统计学差异。在土家族患者中检测到三种新的突变类型223C＞(R75W),257C＞G(T86R)及475G>A(D159N)。223C＞T (R75W)虽被the connexin deafness homepage网站收录,但在本研究中被认为引起非综合症性耳聋而不是综合性耳聋,因此也归为新的遗传突变。线粒体DNA12S rRNA A1555G突变是该地区苗族和土家族人群常见的耳聋致病基因,均高于文献报道的汉族中的A1555G突变率。这种现象主要与环境因素有关,特别是与湘西地区对氨基糖苷类抗生素的大量使用有关。苗族、土家族和汉族耳聋患者的SLC26A4IVS7-2A>G,无统计学差异。未检测出2168A>G (H723R)突变。可见IVS7-2A>G也是湘西苗族,土家族耳聋患者常见的SLC26A4基因致病突变。结论：GJB2基因突变在不同人群的分布相似性及高发突变类型及携带率的差异性,既反映了湖南地区三个少数民族人群的遗传同源性也显示了种族的遗传异质性,与其起源和历史原因等导致的长期人群聚集通婚及种族间的交流有关。研究目的：有研究者发现存在核遗传背景可能影响A1555G突变相关听力丧失能否发生。而A1555G点突变的耳聋患者中,GJB2基因突变的携带率较高。在本研究中我们就核基因GJB2是否与药毒性耳聋相关,与A1555G是否存在关联性,其表达是否会受到氨基糖苷类抗生素的影响进行初步的探讨,为药物中毒性耳聋机制的探索以及防治寻求一个新的方向。研究方法：1、我们在携带mtDNA12S rRNA1555A>G点突变的21例散发个家系中检测GJB2基因突变的携带率,以明确GJB2突变与该类患者表型的关系。2、我们应用免疫组化染色、western blot和real-time PCR的方法观察单次大剂量的庆大霉素注射的大鼠耳蜗外侧壁不同时段Cx26表达的影响以及药物中毒性聋大鼠耳蜗外侧壁Cx26的表达,从而从分子水平探讨药毒性耳聋的发病机制。研究结果:1、我们在携带mtDNA12S rRNA1555A>G点突变的多个家系中检测GJB2基因突变的携带率,检测到两种GJB2基因突变109G>A及79G>A+341A>G,其携带率较听力正常并携带1555A>G的对照组家系成员高。同时携带GJB2突变及1555A>G突变的先证者其耳聋程度较无GJB2突变严重,这意味着杂合的GJB2突变可能促使1555A>G突变携带者其耳聋的发生。2、单次大剂量的静脉注射庆大霉素可以快速的影响Cx26蛋白的表达和分布。但是CX26蛋白水平的增加是一过性,而且与mRNA水平变化不一致。庆大霉素也引起Cx26mRNA增加,但是增加的nRNA不能成功的翻译成蛋白质。结论：在1555A>G携带者中GJB2基因突变携带率高,且携带GJB2突变及1555A>G突变的患者耳聋程度较重,GJB2基因也可能是氨基糖苷类抗生素的促进因素。Cx26是庆大霉素作用后,尚未出现任何毒性反应和耳蜗功能改变前最先发生改变的生物标志物。在耳毒性聋的急性阶段,Cx26的在耳蜗的重新分布和高表达可能增加内淋巴钾离子浓度及提高EP,很可能发挥了重要的拮抗机制,从而发挥一定的保护作用。本研究为氨基糖苷类抗生素引起的耳毒性聋的病理机制的研究和预防提供了一个新的方向。氨基糖苷类如何调节Cx26基因转录和翻译尚待研究,本研究是Cx26在氨基糖苷类抗生素的耳毒性作用机制中所发挥作用的初步探讨,还需要更深入的调查研究和实验证明。