沙雷氏菌RNA结合蛋白的鉴定与功能分析

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普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3分离自小麦内茎,是一种能产生几丁质酶、蛋白酶和硝吡咯菌素等多种抗真菌因子的内生细菌。平板对峙测定表明菌株G3对多种植物病原真菌具有明显的拮抗作用。Hfq和RsmA是细菌中相对保守的2个RNA结合蛋白,在转录后全局水平调控细菌基因表达,以协调细菌对环境的适应性和生存能力,影响细菌多种生理过程。本研究以S.plymuthica G3为模式细菌,通过基因克隆、过表达,以及突变体和互补分析等策略,初步鉴定了RNA结合蛋白Hfq和RsmA及其功能。主要结论如下:(1)对2个RNA结合蛋白Hfq与RsmA编码基因进行分子克隆和测序,并进行了生物信息学和系统进化分析。(2)分别构建了G3/hfq+及G3/rsmA+过表达菌株,并利用Western blot鉴定证明了表达的正确性。通过基因同源重组构建了hfq基因删除、插入突变菌株,并构建了相应的互补菌株和空载体对照菌株。(3)通过突变和互补分析表明Hfq参与正向调控生防菌S.plymuthicaG3的蛋白酶和几丁质酶的分泌、抑菌活性、运动性以及生物膜形成等生防相关表型。与野生菌G3相比,hfq基因突变株G3Δhfq的胞外酶和抑菌活性明显下降,运动性和生物膜形成能力减弱;而互补菌株G3Δhfq/hfq+的上述相关表型得到了一定程度的恢复。(4)过表达分析表明RsmA主要作为负调控子全局控制生防相关表型。与野生菌G3相比,RsmA过表达菌株G3/rsmA+的蛋白酶和几丁质酶活性和抑菌能力明显减弱,运动性和生物膜形成能力也有一定程度的下降,而表达空质粒的对照菌株则与野生菌具有相似的表型。以上结果说明RNA结合蛋白Hfq和RsmA与生防菌S.plymuthica内生菌株G3的生防能力密切相关,展示出很大的潜能作为遗传操纵的靶标,用于构建工程菌株改良生防效率和稳定性,为优化生防微生物接种体提供新策略。
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