热休克蛋白90(90 k Da heat shock protein,Hsp90)是普遍存在于原核和真核细胞中的一种必不可少且高度保守的分子伴侣,通过与细胞内多种客户蛋白形成复合体,协助这些客户蛋白在细胞内转运、跨膜,参与蛋白质的折叠、伸展及多聚复合体的组装,从而起到维持细胞内蛋白质稳定的作用。研究证实,Hsp90在多种癌症细胞中表达水平均明显上升,Hsp90可以通过帮助其下游多种致癌客户蛋白的折叠、装配和成熟,促进癌细胞的生存和侵袭,并对癌症细胞在面对体内外许多不利环境(如放、化疗)时具有保护作用。因此,抑制Hsp90活性已经成为癌症治疗的一个有效策略。在过去的二十年里,涌现出了多种Hsp90抑制剂,如嘌呤支架类化合物格尔德霉素(geldanamycin)及其衍生物17-AAG、天然产物根赤壳菌素(radicicol)和一些小分子肽类等。这些Hsp90抑制剂多以阻断Hsp90 N端的ATP结合位点为机制。迄今为止,已有17种药物进入临床试验。然而,细胞内广泛存在的其他ATP酶使得这些药物无法做到高度特异,其临床效果均不理想,至今未有一个通过美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)认证。Hsp90在细胞内通过结合和水解ATP,形成一个闭合的ATP循环,并在ATP循环的不同阶段顺次结合和释放不同的共分子伴侣(cochaperones)。这些共分子伴侣包括Cdc37,Aha1,p23/Sba1,Hop,Hsp70及Hsp40等,每个共分子伴侣分工不同,分别负责结合不同种类的客户蛋白。其中,Cdc37主要负责将激酶类客户蛋白(kinase client proteins)装载到Hsp90超分子伴侣复合物(superchaperone complex),并进一步催化其结构成熟。这些激酶客户蛋白很多都在癌症细胞中过度表达或活化,与癌症发生与发展密切相关。Hsp90/Cdc37复合物在激酶成熟过程中的关键作用使其成为癌症治疗的一个新的靶点。以Hsp90/Cdc37为靶标进行小分子抑制剂筛选研究,有望为癌症治疗提供全新的有效策略。Hsp90与Cdc37之间作用方式复杂,Hsp90的N端与Cdc37的C端通过一个面积约为1056?2的平面结合,这一平面可划分为疏水作用区和极性作用区两个区域,包含多个氨基酸位点间的相互作用。这种结构复杂性给Hsp90/Cdc37抑制剂研究造成了一定的困难。目前,国内外对Hsp90/Cdc37相互作用的研究多采用传统的蛋白质相互作用研究方法,如免疫共沉淀、NMR和晶体学技术,并多使用体外纯化的蛋白结构片段。这些研究方法不能真实反映Hsp90/Cdc37之间的相互作用本质,并且只能定性地描述Hsp90和Cdc37的相互作用状态,无法定量反映Hsp90与Cdc37间结合水平差异,故均不适用于Hsp90/Cdc37抑制剂筛选研究。因此,引入新的有效的方法来定量反映不同化合物对Hsp90/Cdc37结合水平影响差异,对Hsp90/Cdc37抑制剂研究具有特殊重要性和迫切性。在前期工作中,我们采用了一种新型生物发光技术,海肾荧光素酶双分子互补技术(split renilla luciferase protein fragment-assisted complementation,SRL-PFAC),在存活状态下的HEK293细胞中对Hsp90/Cdc37相互作用进行了研究,逐一分析了位于结合平面内的各氨基酸位点对二者结合的影响差异。我们的研究结果表明,SRL-PFAC技术可以特异性地监测Hsp90/Cdc37之间的相互作用,并敏感地定量反映Hsp90/Cdc37结合水平差异,因此可以作为Hsp90/Cdc37抑制剂筛选的有效手段。但我们构建的Hsp90/Cdc37 SRL-PFAC真核检测系统需要对细胞进行瞬时转染,并用化合物处理转染过的细胞。实验耗时较长,难度较大,需要大量的成本和时间投入。这些因素使得Hsp90/Cdc37 SRL-PFAC真核检测系统不太适合用于Hsp90/Cdc37抑制剂的大量筛选,而更适合用于已鉴定化合物的进一步确证和机制分析。基于上述原因,在本研究中,我们对前期建立的Hsp90/Cdc37 SRL-PFAC真核检测系统进行了改造,首次建立了Hsp90/Cdc37 SRL-PFAC原核表达体系,用于Hsp90/Cdc37抑制剂的大规模筛选。我们以原核表达质粒p ET-30a为载体,分别将人源全长的Hsp90α和Cdc37克隆到RL的N端(氨基酸1-229)和C端(氨基酸230-311),得到p ET-30a-NRL-Hsp90α和p ET-30a-Cdc37-CRL表达质粒,并尝试在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化重组的NRL-Hsp90α和Cdc37-CRL融合蛋白。由于两蛋白分子量均较大,在大肠杆菌中均倾向以包涵体形式表达,无法用于活性研究。我们对两蛋白的诱导条件进行了优化,考察了不同诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对蛋白表达的影响,成功获得了NRL-Hsp90α和Cdc37-CRL蛋白的可溶性表达。我们进一步优化了两蛋白的纯化条件,采用梯度浓度洗脱液进行洗脱,得到两蛋白产量分别为1.0 mg/L和3.0 mg/L,纯度均高于90%。我们应用纯化的NRL-Hsp90α和Cdc37-CRL蛋白进行了互补荧光素酶活性检测,考察了不同蛋白浓度、反应缓冲液、孵育时间和温度对两蛋白互补活性的影响,实验结果显示,两蛋白在超滤去盐的洗脱缓冲液中,以10μM浓度4℃条件下等摩尔比孵育10 min,显示出高水平的互补RL活性。在此基础上,我们分别对NRL-Hsp90α和Cdc37-CRL蛋白进行了点突变,纯化得到了NRL-Hsp90α(Q133A)和Cdc37(R167A)-CRL突变体蛋白,我们在前期研究中证实了这两个位点突变在真核细胞中可以阻断Hsp90/Cdc37结合,进而导致互补RL活性降低。我们用这两个突变体蛋白来评估建立的SRL-PFAC原核检测方法的特异性,结果显示,和野生型蛋白相比,两种突变蛋白均只保留了约20%的互补RL活性,表明纯化的NRL-Hsp90α和Cdc37-CRL蛋白是通过Hsp90/Cdc37相互作用而显示出互补RL活性,阻断Hsp90/Cdc37结合即可导致RL活性降低。我们进一步选取了6种已知的Hsp90抑制剂来检测方法敏感性,我们还克隆和纯化了全长的RL蛋白作为对照用以排除小分子化合物对RL酶活的非特异性抑制。结果显示,LBH-589和17-AAG对NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL活性无抑制作用,表明其不影响Hsp90/Cdc37结合;sulforaphane、withaferin A、celastrol和EGCG均可浓度依赖性地降低NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补活性,其中sulforaphane和withaferin A对RL酶活不显示非特异性抑制作用,表明sulforaphane和withaferin A可阻断Hsp90/Cdc37结合;celastrol和EGCG可同时浓度依赖性降低全长RL的活性,但二者降低NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补活性和RL酶活的趋势有所不同,表明EGCG是通过抑制RL酶活而非阻断Hsp90/Cdc37结合而导致NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补活性降低,而celastrol则是通过抑制RL酶活和阻断Hsp90/Cdc37结合共同作用导致NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补活性降低。上述实验结果与已有报道及我们的前期研究结果一致,这表明我们构建的SRL-PFAC原核检测系统能够敏感并精确地反映小分子化合物对Hsp90/Cdc37相互作用的影响,适用于Hsp90/Cdc37抑制剂筛选研究。我们利用建立的SRL-PFAC原核检测方法,对60余种小分子化合物进行了初步筛选,得到的潜力候选化合物进一步用SRL-PFAC真核检测方法进行验证和机理分析。我们使用前期构建的pc DNA3.1(+)-NRL-Hsp90α和pc DNA3.1(+)-Cdc37-CRL真核表达质粒共转染HEK293细胞,采用梯度浓度的候选化合物处理转染细胞,收集细胞测定互补RL活性,并检测蛋白浓度用以线性化转染效率。通过筛选发现,存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物——芹菜素(apigenin)能够剂量依赖性地降低HEK293细胞中NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL蛋白的互补RL活性,并对全长RL活性不产生影响。我们进一步选取了四种芹菜素的结构类似物:高良姜素(galangin)、黄芩苷(baicalein)、柚皮素(genistein)和染料木素(naringenin),考察它们对Hsp90/Cdc37的影响,结果显示这四种结构类似物均对NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补活性无作用,这些数据表明,芹菜素可以结构特异性地阻断Hsp90/Cdc37相互作用。有报道指出,芹菜素可能通过抑制CK2(casein kinase II)蛋白激酶活性,下调Cdc37 N端Ser13磷酸化水平,导致Hsp90/Cdc37复合物解聚。因此,我们选取了CK2激酶特异性抑制剂TBB(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole),考察其是否与芹菜素具有相同的NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL抑制活性。实验结果显示,TBB对两蛋白互补活性无抑制作用,表明抑制CK2激酶活性不影响NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL互补反应,这提示芹菜素对NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL的抑制作用并不是通过抑制CK2来实现的。为进一步验证该结果,我们将Cdc37 N端的Ser13位点突变为Ala,以模拟其持续去磷酸化状态,实验结果显示,NRL-Hsp90α仍能与Cdc37(Ser13Ala)-CRL产生互补RL活性,而芹菜素可以浓度依赖性地降低二者互补活性,趋势与其对野生型蛋白作用一致,表明芹菜素对NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL抑制与Cdc37 Ser13磷酸化程度无关。这些实验结果均表明,芹菜素可以直接阻断Hsp90/Cdc37相互作用,而非通过抑制CK2活性间接影响Hsp90/Cdc37复合物稳定性。我们进一步在胰腺癌细胞中对芹菜素的活性和机制进行了考察。免疫共沉淀和免疫印迹分析结果显示,芹菜素可以有效阻断MIAPa Ca-2细胞中Hsp90/Cdc37复合物的形成,并浓度依赖和时间依赖性地诱导Hsp90/Cdc37下游客户蛋白Akt、CDK4和MMP-9降解。在此基础上,我们选取了四株胰腺癌细胞MIAPa Ca-2、PANC-1、As Pc-1和Bx PC-3检测芹菜素对细胞生长的影响,实验结果显示芹菜素可以有效抑制这四株细胞生长,IC50值分别为47.90±3.12μM,51.17±3.08μM,30.62±4.31μM和13.57±2.06μM。我们在这四株胰腺癌细胞中进一步选取了高度迁移性的MIAPa Ca-2细胞和中度迁移性的PANC-1细胞,考察芹菜素对细胞移动能力的影响,划痕实验结果表明芹菜素能够浓度依赖性地抑制两种细胞的迁移能力。我们还考察了芹菜素对MIAPa Ca-2和PANC-1细胞中ROS(reactive oxygen species)水平的影响,DCFH-DA(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate)探针分析结果显示,芹菜素能够浓度依赖性地诱导ROS在这两种胰腺癌细胞内迅速积累。上述研究结果表明,芹菜素作为Hsp90/Cdc37的结构特异性抑制剂,可以在胰腺癌细胞中直接阻断Hsp90/Cdc37的相互作用,并导致下游激酶客户蛋白降解,进而诱导胰腺癌细胞内ROS的积累并抑制细胞的生长和迁移。综上所述,在本研究中,我们建立了基于Hsp90/Cdc37的SRL-PFAC原核检测方法,并对其进行了优化。我们利用这一方法进行了Hsp90/Cdc37抑制剂的初步筛选,研究发现黄酮类化合物芹菜素可以有效阻断NRL-Hsp90α/Cdc37-CRL的互补活性。我们在真核细胞HEK293中对芹菜素的作用机理进行了验证,结果表明芹菜素可以直接阻断Hsp90/Cdc37复合物形成。我们进一步在胰腺癌细胞中考察了芹菜素的活性,结果显示芹菜素可以有效阻断胰腺癌细胞中Hsp90/Cdc37相互作用,诱导下游激酶客户蛋白降解,导致胰腺癌细胞内ROS迅速积累,最终抑制胰腺癌细胞的生长和迁移能力。本研究为Hsp90/Cdc37蛋白复合物研究提供新的研究策略,并为开发通过阻断Hsp90/Cdc37相互作用抑制胰腺癌生长的新型Hsp90抑制剂提供理论依据。