小鼠精原干细胞移植模型的建立

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在雄性动物中,精原干细胞在睾丸曲精细管内不断的进行自我更新和分化,是精子发生过程的基础。精原干细胞移植技术是精原干细胞的鉴定的金标准。同时也为治疗雄性不育提供了可能性。本研究是旨在为实验室建立小鼠睾丸模型的平台,为实验室大动物精原干细胞的技术体系奠定基础。第一章:探索白消安处理的条件。试验采用不同的注射部位和不同的白消安浓度来处理小鼠,探索利用白消安清除小鼠精原干细胞的最佳条件。将睾丸相对体重(mg/100g),曲精细管中空率,以及死亡率等参数作为处理效果的检测标准。试验结果显示:阴囊注射白消安10mg· kg-1/侧,在处理后6周时相对睾丸重量降到最低。而15mg·kg-1/侧组在第4周降到最低,达93%,且与第3周差异显著,但与第5周,第6周之间差异不显著。所以15mg· kg-1/侧组处理效果比10mg· kg-1/侧组更好。腹腔注射的三个浓度组,相对睾丸重量从第4周开始与第3周之间差异显著,达到了比较低的水平,但与第5周,第6周之间差异不显著。阴囊注射后第3天,曲精细管中空率与第Od的对照组相比,有明显的处理效果,差异显著。阴囊注射10mg· kg-1/侧组在白消安处理后第6周时,曲精细管中空率达到100%。阴囊注射15mg· kg-1/侧组在第4周时,就达到了100%的中空率,但与第5周,第6周差异不显著。腹腔注射各浓度组从第4周开始,曲精细管中空率都达到100%。之后第5周和第6周曲精细管状态并没有恢复,并维持100%中空状态。总之各组在白消安注射后,睾丸曲精细管内的细胞逐渐死亡,中空率都不断的增高。曲精细管切片观察发现曲精细管内的细胞出现细胞核固缩,核体积变小,是细胞死亡的特征。对于小鼠的死亡率,注射浓度之间没有差异。但是随着注射浓度的增高,死亡率也有随之增高的趋势。腹腔注射40mg·kg-1的死亡率达到近50%,由此可知,白消安处理小鼠的半数致死率(LD50)为40mg· kg-1。虽然与其他各组差异不显著,但是明显要高于其他组。阴囊注射15mg· kg-1和腹腔注射35mg· kg-1死亡率差别不大,但是比43mg· kg-1组的死亡率低了25%左右。所以最后筛选出的最佳注射方法是阴囊注射法,注射浓度是15mg· kg-1/侧,后期移植的最佳处理时间第5周以保障所移植的供体细胞具有较高的存活率。第二章:利用第一章探索到的白消安处理的条件用来进行受体的制备,然后进行精原干细胞的移植和移植后的检测。试验结果表明,首先合成了9对微卫星引物,并找到了各对引物扩增的最佳退火温度。移植3个月后,进行微卫星检测,在受体鼠附睾的基因组中并未发现供体鼠的微卫星条带。综上所述,本试验优化了白消安注射的条件,熟练的掌握了精原干细胞输出管移植法,为本实验室的小鼠睾丸模型建立了一个技术平台。但是因为注射的细胞并没有在受体鼠睾丸内正常的发育分化,说明方法还不够成熟,需要进一步的探索。
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