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自体皮片移植是治疗皮肤创伤的传统方法,但自体皮源不足是大面积创伤救治过程中的难题。除自体皮片移植以外,组织工程皮肤为治疗皮肤损伤提供了一种来源充足而有效的治疗方法。目前已研制了多种组织工程真皮产品且部分商品经美国FDA批准用于临床。2007年11月第四军医大学口腔医学院组织工程实验中心研究开发的组织工程皮肤产品通过国家鉴定,成为我国第一个组织工程产品,现已应用于临床治疗,为临床的各种皮肤损伤提供了足够的可供移植的皮肤来源。然而由于目前组织工程皮肤产品缺乏血管结构,移植后无法为组织工程真皮种子细胞的分裂、增殖提供充足的营养和氧气,即充足的血液供应。使其在面积较大和深度皮肤损伤的移植成功率和修复效果受到一定的影响。所以提高组织工程真皮的血管化对改善其移植成活率及修复效果具有重要的意义。本研究从构建组织工程所用的种子细胞、支架材料和缓释系统等方面出发对组织工程真皮的血管化问题进行了一定的研究。实验分四部分进行,具体内容如下:1.作为血管化组织工程真皮种子细胞人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定酶消化法获得人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)种子细胞,通过倒置相差显微镜,免疫荧光组织化学检测第VIII因子相关抗原的表达、扫描电子显微镜观察细胞表面结构及其排列方式和透射电子显微镜观察Weibel-Palade小体进行细胞鉴定,结果显示通过本实验方法所获得的细胞为纯度较高,生长状态良好的HUVEC。2.新生小牛皮I型胶原复合HUVEC和成纤维细胞构建含血管样结构组织工程真皮的研究通过种子细胞HUVEC和人皮肤成纤维细胞(fibroblast,Fb)的接触和非接触共培养,在二维和三维维条件下探讨Fb对HUVEC形成血管的作用,构建含血管样结构组织工程真皮。将获得的HUVEC细胞传代培养至第3代作为实验细胞,应用插入式培养皿进行HUVEC与Fb非接触培养,同时用Hoechst 33342标记HUVEC后与Fb按不同比例混合进行二维接触培养,相差显微镜和荧光显微镜观察。将第3代HUVEC与Fb按1:1比例混合后复合胶原(细胞密度106/ml)进行三维培养,构建含血管样结构组织工程真皮,HE染色观察。HUVEC与混合后复合胶原(细胞密度106/ml)进行三维培养构建含血管样结构组织工程真皮,HE染色观察。实验结果表明在二维和三维条件下Fb均可促进HUVEC形成血管样结构,本实验成功构建出含血管样结构的组织工程真皮。3.猪脱细胞真皮基质复合HUVEC构建含血管样结构组织工程真皮的研究通过改良方法制备高空隙率猪脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix, ADM),将其作为组织工程真皮支架材料复合HUVEC和Fb进行体外培养,探讨作为组织工程支架材料的ADM在构建含血管样结构组织工程真皮的作用及应用。利用改良的胰酶-胶原酶双重消化法制备高空隙率ADM,通过HE染色、扫描电镜和强度测试仪对ADM进行观察测定,结果显示ADM具有较高空隙率和较大的断裂强度。ADM分别复合Fb和HUVEC进行共培养测定ADM的细胞相容性,同时将HUVEC(106/ml)注入ADM大空隙中体外培养,通过HE染色和扫描电镜进行形态学观察,结果显示以ADM为支架材料复合HUVEC可体外构建含有血管样结构的组织工程真皮。动物体内实验以无细胞ADM作为对照组,复合HUVEC的ADM作为实验组进行裸鼠皮下移植实验,HE染色结果显示移植后2 W,无血管形成,移植后3 W,对照组无血管形成,而实验组有大量血管样结构形成,抗人CD31单克隆体和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性,表明在体外由ADM复合HUVEC构建的是含血管样结构的组织工程真皮,动物体内移植后参与血管形成,提高组织工程真皮移植后血管形成速度,进而提高移植后的成功率。4.明胶缓释微球系统促进组织工程皮肤血管化的研究细胞因子碱性纤维细胞生长因子(bisic fiberoblast growth factor, bFGF)在血管发生和再生过程中发挥非常重要的作用,在适当的浓度下可以促进新生血管的生长。在体外构建含血管样结构组织工程真皮,由于培养液为间断性定期更换,难以维持培养液中和组织工程真皮深部bFGF浓度的稳定。为了保证培养液中bFGF浓度的稳定,本实验利用明胶微球缓释系统复合bFGF ,通过明胶微球的缓释作用维持培养液中bFGF浓度的恒定。通过HUVEC和Fb与明胶微球共培养检测明胶微球的生物相容性,体外溶出度测定方法测定明胶微球缓释曲线,利用复合bFGF的明胶微球混合胶原纤维作为组织工程真皮支架材料,以HUVEC作为种子细胞,FAD培养液体外共培养构建含血管样结构的组织工程真皮;在其他条件相同的情况下,使用未复合bFGF明胶微球和加入50ng/ml浓度bFGF的FAD培养液作为对照构建组织工程真皮,实验结果显示5d实验组有血管样结构形成,而对照组很少有血管样结构形成。本实验提示通过明胶微球复合生长因子可以提高HUVEC形成血管速度,为组织工程组织体内移植提高血管再生和长入速度,进而提高移植成功率提供了一种途径和方法。