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第一部分缺氧通过HIF-1α诱导心肌细胞分泌细胞因子TNF-α目的：越来越多证据显示急性心肌梗死中过量肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表达对心肌细胞不利。心肌缺血时,TNF-α主要来源于巨噬细胞。随着缺血状态的持续,心肌细胞开始分泌TNF-α.我们探讨缺氧是否通过缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)诱导心肌细胞自分泌细胞因子TNF-α。方法和结果：分离新生大鼠乳鼠心肌细胞,分别给予氧浓度1%缺氧刺激5分钟,15分钟,30分钟,1小时,2小时,4小时,6小时,12小时,24小时。western blot检测细胞HIF-1α蛋白表达水平；免疫荧光检测HIF-1α蛋白表达以及入核情况；实时定量RT-PCR检测TNF-a mRNA表达水平；ELISA检测TNF-α蛋白表达分泌。结果显示TNF-αmRNA从1小时开始表达上调,与空白组相比增加至1.99±0.27倍(p<0.01),12小时及24小时达峰值,分别为4.06±0.84倍和4.09±0.81倍(p<0.01)。TNF-α蛋白分泌表达在6小时可检测到,12小时达峰值为48.12±11.52pg/ml(p＜0.01)。缺氧对HIF-1αmRNA水平无影响,HIF-1α蛋白缺氧30分钟表达明显,1小时达峰值。免疫荧光染色提示缺氧15分钟HIF-1α蛋白开始表达且向核内聚积。核转染法进行心肌细胞HIF-1αRNA干扰,发现siRNA显著抑制HIF-1αmRNA水平的同时,抑制缺氧12小时后TNF-αmRNA水平上调(3.75±0.45 fold vs 1.38±0.76 fold,p<0.01)。HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)能有效抑制缺氧刺激后HIF-1α蛋白表达,也能抑制缺氧12小时后TNF-αmRNA水平上调(2.82±0.41 fold vs 1.31±0.37fold,p<0.01)以及蛋白分泌(48.12±11.52pg/ml vs 23.22±2.62,p<0.05)。结论：缺氧能诱导离体心肌细胞分泌细胞因子TNF-α, HIF-1α在缺氧诱导心肌细胞自分泌TNF-α过程中发挥重要调节作用。第二部分缺氧及模拟缺氧状态下HIF-1α对TNF-α直接启动作用的研究目的：探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)对于肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是否有直接启动作用。方法和结果：培养HEK293细胞和HepG2细胞,给予氧浓度1%缺氧刺激及氯化钻模拟缺氧刺激后,western blot检测胞核HIF-1α蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测TNF-αmRNA表达水平。结果显示缺氧6小时及氯化钻刺激3小时可明显观察到HIF-1α蛋白在胞核内稳定表达,缺氧12h及氯化钴刺激12h后与空白组相比TNF-αmRNA水平明显上升。HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)能有效抑制氯化钻模拟缺氧刺激后HIF-1α在核内聚积,也能抑制氯化钴模拟缺氧刺激后TNF-αmRNA水平上调。分析TNF-α转录起始位点上游5000bp的启动子区域,发现七个可能缺氧反应元件(hypoxia response elements, HREs)。5’端续减法构建8个不同长度的报告基因质粒,瞬时转染入HEK293细胞和HepG2细胞,予氧浓度1%缺氧刺激24小时后双荧光素酶报告基因法检测启动子活性。结果显示TNF-α转录起始位点上游-1470bp处可能为缺氧诱导TNF-α启动子的功能位点。结论：我们发现TNF-α是一种缺氧诱导表达基因,它的转录调节可能通过HIF-1与位于TNF-α启动子-1470bp处HRE位点相互作用发挥效应。