【摘 要】
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研究背景:发生于年轻恒牙的牙髓及根尖周病会导致牙本质形成不足,牙根短小,严重者导致恒牙早失,影响患儿咀嚼系统发育,治疗这类患牙的根本方法是促进牙本质再生。牙根未发育完成的牙齿根尖组织可以分离出根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）,因其具有良好的干细胞特性,在牙本质再生方面发挥作用。长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lncR
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研究背景:发生于年轻恒牙的牙髓及根尖周病会导致牙本质形成不足,牙根短小,严重者导致恒牙早失,影响患儿咀嚼系统发育,治疗这类患牙的根本方法是促进牙本质再生。牙根未发育完成的牙齿根尖组织可以分离出根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）,因其具有良好的干细胞特性,在牙本质再生方面发挥作用。长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）是一种几乎不编码蛋白的RNA,广泛参与多种细胞活动。已有研究发现lncRNAs在干细胞定向分化方面发挥重要作用,但其作用机制尚未阐明。因此,本课题将建立SCAP矿化诱导前后lncRNAs表达谱,通过R语言,筛选出在SCAP矿化诱导后发生差异表达的lncRNAs,选择改变明显的lncRNA进行qRT-PCR验证,确定未表征功能的lncRNA NHS-AS1作为研究目标,探究NHS-AS1在SCAP成骨/成牙本质向分化过程中的生物学功能,并阐明其作用机制,丰富牙本质再生的方法。研究目的:1.探究lncRNA NHS-AS1对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响;2.探究lncRNA NHS-AS1调控SCAP成骨/成牙本质向分化的分子机制。实验方法:1.酶解组织块法分离培养SCAP,流式细胞术进行SCAP表面标志物检测;碱性磷酸酶/茜素红染色以及油红O染色证明SCAP多向分化能力。2.通过细胞转染技术使SCAP过表达NHS-AS1,应用qRT-PCR、Western Blot实验检测矿化相关基因的表达水平,明确NHS-AS1的生物学功能。3.通过线上数据库预测NHS-AS1和miR-5011-5p以及miR-501 1-5p和SMAD7的结合位点;双荧光素酶报告基因实验进行验证。4.通过细胞转染技术和功能实验探究miR-5011-5p和SMAD7对SCAP成骨/成牙本质向分化的调控作用。5.通过细胞共转染技术、挽救实验和功能实验,验证NHS-AS1/miR-5011-5p/SMAD7在SCAP成骨/成牙本质向分化过程中的关系。实验结果:1.体外分离培养的SCAP表达间充质干细胞表面标志物,在定向诱导条件下,可成骨和成脂向分化。2.NHS-AS1抑制SCAP成骨/成牙本质向分化;3.NHS-AS1可作为miR-5011-5p海绵发挥作用,过表达miR-5011-5p后SCAP成骨/成牙本质向分化能力增强,挽救实验证明miR-5011-5p可部分逆转NHS-AS1对SCAP成骨/成牙本质向分化的抑制作用。4.SMAD7 是 miR-5011-5p 靶基因,NHS-AS1通过吸附 miR-5011-5p 上调 SMAD7的表达。5.过表达SMAD7后SCAP成骨/成牙本质向分化能力减弱,SMAD7可部分逆转miR-5011-5p对SCAP成骨/成牙本质向分化的促进作用。结论:1.首次发现lncRNA NHS-AS1抑制SCAP成骨/成牙本质向分化;2.NHS-AS1通过吸附miR-5011-5p上调SMAD7的表达;3.NHS-AS1/miR-S011-5p/SMAD7轴调控SCAP成骨/成牙本质向分化。
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