研究背景创面修复是一个复杂的生物系统工程,其中有多种细胞、生长因子及细胞因子共同参与,通过多种细胞水平及分子水平的改变,重建皮肤的屏障功能。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作为一种具有多向分化潜能的细胞,可参与皮肤重建过程的血管化及上皮化过程。但是BMSCs的动员、趋化、聚集主要由基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)的趋化作用实现。当组织损伤或缺血、缺氧时,可以诱导局部组织的SDF-1表达上调,产生的SDF-1可趋化、诱导BMSCs到损伤部位并归巢,参与局部血管化和创面修复。因此,局部形成高浓度SDF-1是吸引并捕捉干细胞参与血管修复的必要条件。然而,如何在局部形成SDF-1浓度梯度分布是一个难题。直接局部血管内注射SDF-1迅速被血液稀释进入全身循环而不能在局部形成有效浓度;而直接组织内注射SDF-1分布不均匀,易降解,且进入循环的效率不确定。将蛋白质多肽类药物通过可生物降解的微球系统给药,不仅能有效防止药物在体内的快速降解,还可将药物靶向输送至体内有效部位,达到定向释放效应。在临床治疗中,病变部位发生的物理、化学或生物特性的改变,均能作为引起纳米粒反应的靶点。而活性氧(reactive oxygen species,ROS)就是这样一个在生物体内正常存在的物质,在多种疾病如创伤和炎症性疾病中过量产生。因此为载药纳米粒的靶向释放提供新的靶点。在本课题中,我们设想利用硫醇缩酮聚合物PPADT作为纳米粒载体,制备出包载SDF-1的ROS敏感纳米颗粒,通过静脉给药,使纳米颗粒能在创面周围组织释放SDF-1,在局部形成了有效稳定的SDF-1浓度梯度,从而促进BMSCs向损伤局部趋化归巢,促进创周局部血管化,加快创面愈合。研究方法:1、载SDF-1α的ROS敏感纳米粒(SDF-1α-PPADT)的构建及体外鉴定(1)ROS敏感硫醇缩酮聚合物(PPADT)的合成合成PPADT;通过生物核磁共振(1H-NMR,13C-NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)验证其化学结构与分子量,确证所获得的PPADT化学结构与预期相符。(2)SDF-1α-PPADT纳米粒的制备与性能鉴定采用复乳溶剂挥发发制备SDF-1α-PPADT纳米粒;通过透射电子显微镜(TEM)、粒径分析仪观测其表征;(3)BCA法测纳米粒中蛋白含量,计算SDF-1α-PPADT载药量。(4)CCK8法评价纳米粒的细胞毒性试验;(5)SDF-1α-PPADT纳米粒的体外释放实验,评价纳米粒的ROS敏感释放行为;(6)Transwell小室实验评价纳米粒中SDF-1α的生物活性;2、SDF-1α-PPADT纳米粒对急性创面小鼠的体内实验研究(1)PPADT纳米粒的体内生物毒性评价静脉输注纳米粒后,观察动物死亡率,血清酶学(CK、ALT、AST),H&E染色观察主要脏器病理学改变。(2)评价SDF-1α-PPADT纳米粒在动物模型体内的靶向释放(3)评价SDF-1α-PPADT纳米粒对体内SDF-1α的影响(4)评价SDF-1α-PPADT纳米粒对BMSCs的趋化和归巢作用通过外源性绿色荧光蛋白标记的BMSCs,观察SDF-1α-PPADT对BMSCs的局部趋化作用,激光共聚焦显微镜观察创周GFP+CD31+的细胞数量。(5)评价SDF-1α-PPADT纳米粒对创周血管化影响及创面愈合的影响免疫组化观察创周组织血管化程度(CD31)。动态观察创面愈合时间,记录创面愈合率。研究结果1、合成的活性氧敏感高分子材料PPADT分子量为11544Da,分散度为1.974,可作为纳米粒的载体。通过复乳溶剂挥发法制备SDF-1α-PPADT纳米粒,纳米粒粒径为124.7±27.47nm,载药率为1.8%,透射电子显微镜下观察,纳米颗粒呈球形,大小均匀,无粘连。2、不同浓度PPADT纳米粒与小鼠肺泡巨噬细胞RAW264.7共同培养24小时,CCK8法检测发现各组PPADT纳米粒对细胞增殖活性均无影响。将SDF-1α-PPADT纳米粒分别暴露于PBS溶液(低ROS)与Fenton试剂(高ROS)中释放,48h内PBS溶液中的纳米粒仅有5%释放。而Fenton试剂中的纳米粒在8h时已释放了82.56%,并在48h内完全释放。通过Transwell小室实验评价纳米粒中的SDF-1α的活性,结果表明相同浓度的SDF-1标准品与纳米粒中SDF-1α趋化活性比为1:0.73。3、不同浓度的SDF-1α-PPADT纳米粒静脉注入小鼠体内,7天观察期内小鼠全部存活。病理切片观察主要脏器,未发现明显病理改变或炎细胞浸浸润。CK,AST和ALT酶学指标也未有明显改变(P>0.05)。动物模型静脉注射Cy5-SDF-1α-PPADT纳米粒6小时后,小动物成像仪可见创周高荧光区域。全层皮肤缺损模型组给予SDF-1α-PPADT纳米粒治疗后,血清中SDF-1α水平及创周SDF-1α水平24小时内均能稳定维持在较高水平。全层皮肤缺损模型输注SDF-1α-PPADT纳米粒后,创周组织免疫组化可见血管化程度较对照组更高,CD31阳性细胞更多。而同时输注SDF-1α-PPADT和GFP-BMSCs 3天后,创周冰冻切片可见SDF-1α-PPADT组较其它组有更多GFP+CD31+的细胞。而且SDF-1α-PPADT组创面愈合较其他组更快。研究结论1、成功合成了ROS敏感的高分子有机材料PPADT。通过复乳溶剂挥发法,成功制备出符合粒径要求、具有一定载药量的SDF-1α-PPADT纳米粒。2、合成的SDF-1α-PPADT纳米粒具有ROS敏感活性。可在高浓度ROS环境中释放SDF-1α。且释放出的SDF-1α仍保留有较强趋化活性。该纳米粒对细胞增殖无明显毒副作用,细胞相容性良好。3、合成的SDF-1α-PPADT纳米粒对动物无明显生物毒性,生物相容性好。静脉使用可以实现在创面周围靶向释放。提高循环与创面周围SDF-1α含量。促进BMSCs向创面聚集归巢;促进创面血管化,促进创面愈合。