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染色体结构变异,包括染色体DNA大片段的删除、反转及重复。早期研究利用可编程核酸酶ZFN和TALEN介导基因组靶向DSBs从而实现染色体基因片段的结构变异,但其低效性和不便的操作限制了他们的普及应用。源于细菌和古生菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是新兴基因组编辑技术,近来被广泛应用在真核细胞基因组的染色体DNA片段的结构变异。当细胞通过NHEJ途径修复DSB时,在DNA片段的连接处发生indel突变是大概率事件,也降低了精准的DNA片段编辑的效率。由于DNA断裂末端修复产生复杂类型的修复产物是由可编程核酸酶介导的DNA断裂末端形式以及染色体结构变异DNA损伤修复机制共同作用。因此,理解Cas9核酸酶的DNA断裂机制,明确诱导染色体结构变异的DNA损伤修复机理是实现精准可预测的CRISPR基因组片段编辑的前提。本文通过CRISPR DNA末端修复蛋白筛选体系对Alt-NHEJ修复途径的DNA修复蛋白进行干预,发现Ct IP和FANCD2蛋白可作为调控靶点以抑制Alt-NHEJ途径,进而促进细胞中CRISPR/Cas9系统介导的不同长度、不同基因位点、不同染色质状态的DNA大片段精准删除。接着,为了进一步揭示C-NHEJ途径是一种精确的修复途径,我们对C-NHEJ途径相关蛋白XRCC4和DNA Ligase IV进行失活,发现染色体DNA大片段精准删除的效率显著降低,表明Alt-NHEJ途径与C-NHEJ途径竞争性地对DSBs末端进行修复。此外,Ct IP蛋白的末端切割活性依赖于活性位点的磷酸化修饰,利用3AP小分子抑制剂抑制Ct IP蛋白活性位点的磷酸化,能够有效的促进染色体DNA大片段精准删除的效率。最后,我们筛选了Ct IP基因突变的CRISPR细胞克隆,发现这种细胞克隆也可以显著的提高DNA片段精准删除的效率。利用3AP小分子抑制剂处理Ct IP基因突变的细胞克隆能更进一步的提高精准的DNA大片段删除效率。综上,我们可以通过抑制Ct IP蛋白的活性从而在基因组任何位点实现精准的染色体DNA大片段删除。通过CRISPR系统诱导染色体结构变异DNA片段编辑,利用高通量测序技术,对结构变异的断裂修复末端的碱基修复形式进行特征分析发现,断裂末端的核苷酸加入呈现非常有规律的模式。加入的核苷酸通常来自于PAM区上游序列或者两个sg RNAs的PAM区上游序列的组合形式,我们推测这种特定核苷酸的加入是由Cas9核酸酶不平衡的断裂DNA所导致。Cas9核酸酶体外断裂切割实验揭示Ruv C核酸酶结构域切割靶向DNA的非互补链具有多样性,可以断裂在PAM上游的-3,-4,-5等位置,产生具有1-3个核苷酸的5′突出悬端。此外,通过突变Cas9蛋白linker区域重要的氨基酸发现,突变的Cas9核酸酶可介导对靶DNA链灵活可变的切割模式。因此,CRISPR片段编辑技术结合高通量测序实验分析不同sg RNAs靶序列的切割模式有利于实现精准可预测的核苷酸加入。最后,利用这一精准可预测的CRISPR片段编辑方法对Pcdh基因簇的增强子元件进行原位反转等遗传操作,发现处于基因组TAD边界单个CTCF蛋白结合位点的反转能够重塑三维基因组增强子与启动子的相互作用。