KpADH是来源于多孢克鲁维酵母Kluyveromyces polyspora的一种依赖NADPH的醇脱氢酶,可用于（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲酮（CPMK）的高效不对称还原。为了进一步探究和拓展KpADH在不对称还原大位阻双芳基酮底物的应用潜力,本论文以野生型KpADH（WT）为出发酶,CPMK为模式底物,合成了一系列CPMK类似底物以及四种含杂环的双芳基酮底物,以此探索KpADH的底物谱,进一步通过半理性设计构建了对映互补的突变体,并解释了立体选择性调控的分子机制。主要研究内容和结果如下:为了更好的了解KpADH识别双芳基底物的分子机制,首先探究了不同双芳基底物,结果显示随着氯取代基从对位变为间位和邻位,酶的活性和选择性都随之降低,表明苯环上的对氯基团在影响KpADH催化效率和立体选择性中发挥重要作用。将对氯基团替换为对三氟甲基（5a）和对甲基（6a）后,酶的立体选择性发生反转,分别为49%（S）和83%（S）。此外,还合成了4种药用类杂环底物,分别为噻吩环、噻吩氯环、咪唑环和环戊二酮,其中噻吩氯环底物的比活力及立体选择性达到10.8 U·mg-1和81%（R）,进一步证实了对位氯原子基团对于底物在活性中心的定位发挥了重要作用。半理性设计对映互补KpADH突变体以探究立体选择性规律。对底物结合口袋的位点进行定点突变,筛选参与立体选择性调控的位点,对鉴定获得的关键位点E214和T215进行饱和突变探究氨基酸分布规律。进一步迭代突变成功构建最优突变体E214I/T215S/S237A（ISA）和F161V/S196G/E214G（VGG）,其中,（S）-突变体ISA可以催化还原底物5a和6a,双芳基醇产物的e.e.值＞99%（S）;（R）-突变体VGG可以催化还原5a和6a,产物醇的e.e.值分别达到99%（R）和98%（R）。动力学分析显示:突变体ISA和VGG对5a底物的KM值较WT（0.44 m M）有所提高,分别为0.75 m M和0.46 m M;对于底物6a,突变体VGG则与WT保持一致（1.59 m M）,ISA则有所降低（0.77 m M）。为了探索KpADH的蛋白结构及立体选择性调控的分子机制,揭示KpADH对于底物5a和6a的选择性翻转机制,构建失活突变体Y164F并尝试获取底物、辅酶和酶的复合物晶体结构。对蛋白结晶条件进行优化,最终获得高质量晶体,收集到15套高分辨率晶体衍射数据,然而分子置换后并未在活性中心发现底物。通过同源建模,获得对映互补突变体ISA和VGG的同源模型,分别与底物CPMK、5a、6a进行了分子对接和作用力分析,初步揭示了双芳基酮的对位基团和KpADH底物结合口袋的空间位阻及烷基-π作用力对立体选择性调控的重要作用。综上,本研究拓展了KpADH在不对称还原系列双芳基酮底物中的应用,发现对位取代基对立体选择性的重要性,理性设计并构建了对映互补的KpADH突变酶,并基于分子对接和动力学分析初步探索了其手性识别机制。