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双峰驼作为我国西北地区特有物种,由于环境等诸多因素的影响,野生双峰驼的数量正在急剧减少。选择合适的方法对其种质资源进行保护具有重要的意义。考虑到双峰驼较为特殊是生理特性,利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)保护双峰驼的遗传资源是可行的,但iPS细胞的分离方法较为繁琐复杂。CRISPR/Cas9技术是最新的一种基因编辑技术。CRISPR全称为规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats9,CRISPR)。理论上可实现全基因组的基因切割,并在多个物种上得到了证实。结合以上两种比较成熟的技术,本试验成功构建了双峰驼转基因细胞,为后期优化筛选iPS细胞的方法提供了生物材料,并对其诱导为iPS细胞的条件进行了初步探索,主要结果如下:1、表达载体的构建根据Nanog基因只在多能性细胞中表达的现象设计了上下游同源臂,长度分别是2341bp和1775bp。同时,克隆了eGFP基因和neo基因。本试验先将上、下游同源臂连入到pUC,然后连入具有真核启动子的neo基因,最后连入eGFP基因,成功获得了表达载体pUC-up-eGFP-pgk-down。2、切割载体的构建利用在线软件,根据20+NGG的原则在Nanog基因的终止密码子附近设计了三对sgRNA。将其连入到pX330-eGFP中。3、双峰驼转基因细胞的获得将三对切割载体转染到双峰驼胎儿成纤维细胞中,利用T7E1酶切检测各自的切割效率。选取切割效率最高的切割载体和表达载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得基因敲入成功的细胞,并将其用于后续的iPS细胞诱导。4、双峰驼转基因细胞诱导为iPS细胞条件的探索用逆转录病毒将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因转入到双峰驼转基因细胞中,用不同培养方案在低氧环境下进行诱导培养。16d后对其进行碱性磷酸酶检测,表明诱导条件尚需优化。综上所述,本试验在双峰驼胎儿成纤维细胞的Nanog基因后定点敲入了两个基因(eGFP基因和具有真核启动子的neo基因)。成功构建了双峰驼转基因细胞,为后期优化筛选iPS细胞的方法提供了生物材料,并对其诱导为iPS细胞的条件进行了初步探索。