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牛源A型多杀性巴氏杆菌是一种条件致病菌,主要引起牛肺炎,近年来在我国不断流行,严重影响着养牛业的发展。目前我国尚无针对A型多杀性巴氏杆菌的疫苗,给多杀性巴氏杆菌的防控带来了极大困难。有报道,多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下出现溶血现象,但对溶血性的相关分析还研究较少。1多杀性巴氏杆菌溶血特性比较及溶血相关基因ahpA相关研究本试验就6株牛源A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ1-6)在鸡血,兔血和羊血平板上的溶血特性进行比较,克隆并比对了6株菌的溶血相关基因ahpA,构建遗传进化树,同时扩增和比对分析了其上游调控序列。对有氧和厌氧条件下培养的多杀性巴氏杆菌的ahpA基因表达量进行荧光定量分析。构建PmCQ2菌株ahpA基因的原核表达载体ahpA转入大肠杆菌BL-21(DE3),观察该重组菌溶血现象,对ahpA蛋白进行免疫印迹分析和免疫保护性研究。结果显示,PmCQl能够溶解鸡血和兔血；PmCQ2、PmCQ4及PmCQ6能够溶解3种动物红血球；PmCQ5仅能够溶解兔血；而PmCQ3均不能溶解3种动物红血球。PmCQl-6ahpA同源性达100%,且较为保守,上游调控序列也一致。ahpA基因在有氧条件下不表达,仅在厌氧条件下表达,且各株菌间表达量差异显著。重组菌在厌氧条件下溶血,有氧培养不溶血。通过免疫印迹分析和攻毒保护试验,证实ahpA蛋白是一种良好的免疫原。本研究结果初步表明,多杀性巴氏杆菌的溶血差异性与ahpA基因的表达量存在一定关联；ahpA蛋白具有良好的免疫活性。2A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗侯选菌株筛选通过Reed-Muench法计算6株多杀性巴氏杆菌PmCQ1-6对小鼠的LD50(毒力测定)。结果显示PmCQl-6对昆明鼠的LD50分别为3.18×105CFU,2.2×105CFU,6.54×105CFU,3.45×105CFU,3.0×105CFU和1.14×108CFU,以PmCQ2毒力最强,PmCQ6毒力明显低于其他5株。通过交互免疫试验对6株菌进行免疫原性的分析,结果显示,PmCQl-6组交互试验的保护率分别为88.57%,85.71%,77.14%,80%,60%和80%,以PmCQ1保护效果最好,PmCQ2次之,PmCQ5最差。将PmCQ2连续传代,通过接种生化鉴定管,比较原代、第90代和第150代的生化遗传稳定性；通过小鼠攻毒试验,比较原代、第90代和第150代的毒力遗传稳定性。结果表明,PmCQ2的生化和毒力遗传稳定性均较好。综上,PmCQ2可以作为灭活疫苗的候选菌株。3疫苗制备及成品检验经过菌液培养、计数、灭活、油相制备、水相制备和配苗乳化等程序,获得灭活疫苗250mL,含菌量为4×109CFU/mL。接种200μL灭活疫苗于马丁肉汤平板培养,观察有无杂菌生长,进行无菌检验；注射家兔疫苗5mL/只,观察10天,进行安全检验；将疫苗分为0.5mL,1mL,1.5mL3个梯度免疫家兔,对照组免疫无菌PBS,21天后攻毒1MLD的A型多杀性巴氏杆菌,计算保护率,进行效力检验。同时,本试验对牛源A型和B型多杀性巴氏杆菌疫苗进行交叉保护研究。结果显示,无菌检验未检出任何活菌；安全检验中家兔均健活；效力检验显示,家兔免疫1～1.5mL疫苗时,能够对1MLD的A型多杀性巴氏杆菌攻毒提供100%的保护。上述结果说明本研究制备的灭活疫苗安全有效；A型和B型疫苗间有交叉保护作用。