目的及研究背景微重力条件下,人体受力学环境的改变会引起人体多个系统、器官和组织发生显著而持续的生理病理变化,而微重力诱发的骨质丢失是其中非常突出的问题之一。微重力引发的骨质疏松增加了骨折的风险,限制了人类对太空的探索；而且微重力与长期卧床制动诱发的骨质疏松,同属废用性骨质疏松,病理机制非常相似。因此,研究微重力环境下诱发骨质丢失的机制并找到相应的对抗策略,对于宇航人员和长期卧床的人群都具有非常重要的意义。目前,微重力诱发骨质丢失的确切机制尚不清楚,现有的对抗方案也不理想。近些年,氧化应激(Oxidative stress)在骨质疏松病理机制中的作用引起广泛关注。在雌激素水平下降和年龄增长引发的骨质疏松中,都发现活性氧自由基(ROS, Reactive oxygen species)在体内大量蓄积,而且应用抗氧化应激药物在防治上述两种骨质疏松方面也取得了不错的效果。近来,学者们发现氧化应激可能在微重力诱发的骨质丢失方面也起到了非常重要的作用,并且通过体外实验也取得了积极效果。因此,有必要寻找或开发具备抗氧化应激的理想药物,来防治微重力诱发的骨质丢失。姜黄素(C21H20O6)是从姜黄的根茎中提取的一种天然酚醛树脂,是一种天然抗氧化剂以及自由基清除剂。作为烹饪调味品,它已经被东方民族广泛应用,还用于治疗疾病,包括糖尿病、肝胆病变、类风湿关节炎和胃肠病变等。近来,姜黄素作为潜在的治疗绝经后骨质疏松药物引起了科学家的关注。它可以改善绝经后引起的骨质疏松,以及牙周炎引起的骨质丢失。另外,姜黄素可改善APP/PS1转基因小鼠的骨纤维结构和提高骨矿质密度。有的报道认为姜黄素是双向抗氧化剂,它能够直接与活性氧反应,诱导具有细胞保护作用和抗氧化作用的蛋白质表达上调。另外,姜黄素也能够与维生素D受体结合(VDR),激活维生素D受体目标基因的转录。而姜黄素能否缓解微重力条件下引发的骨质丢失,还有待探讨。目的1.研究姜黄素对于模拟微重条力件下成骨细胞代谢和分化等功能的影响,并探讨其作用机制。2.研究姜黄素对于模拟微重条力件下破骨细胞生成和代谢的影响,并探讨其作用机制。3.研究模拟微重力条件对于SD大鼠骨代谢的影响,探讨姜黄素对于模拟微重力条件下SD大鼠骨质丢失的影响及其作用机制。方法1.旋转式细胞培养系统(RCCS, Rotary cell culture system)模拟体外微重力条件,体外培养MC3T3-E1细胞。根据不同处理方法将实验细胞分为四组：(1)1G重力对照组(Con); (2) 1G重力+姜黄素对照组(Con+CUR,4μM);(3)模拟失重组(MG)；(4)模拟失重+姜黄素组(MG+CUR,4μM)。实验组加入姜黄素(4μM)共同模拟微重力条件下培养96h后,检测细胞中ROS产量及培养液中OPG和RANKL含量；用pRT-PCR (Quantitative real-time PCR analysis)法结合Western Blot法检测VDR的表达水平。实验组加入姜黄素(4gM)共同培养7天后,检测ALP活力水平。然后综合评估微重力条件对MC3T3-E1细胞增殖及分化功能的影响,并探讨姜黄素在其中发挥的作用及其机制。2.旋转式细胞培养系统(RCCS, Rotary cell culture system)模拟体外微重力条件,体外培养MC3T3-E1细胞。根据不同处理方法将实验细胞分为五组(1)1g重力组(Con)(2)模拟失重组(MG)；(3)模拟失重+1,25-二羟维生素D组(MG+1,25D,10nM); (4)模拟失重+姜黄素组(MG+curcumin,4 μM)(5)模拟失重+1,25-二羟维生素D+姜黄素组(MG+1,25D+curcumin,4 μM和10 nM)。同方法1,检测ROS、ALP和RANKL/OPG,对比分析姜黄素与1,25D对MC3T3-E1细胞代谢和分化的影响。3.旋转式细胞培养系统(RCCS, Rotary cell culture system)模拟体外微重力条件,体外培养RAW264.7细胞,利用RANKL (20ng/ml)诱导破骨细胞生成。根据不同处理方法,将实验分为4组：(1)模拟失重组(MG组)；(2)模拟失重+姜黄素(4μM)组(MG+CUR组)；(3)1G重力对照组(Con组)；(4)1G重力+姜黄素对照组(Con+CUR组)。实验组加入姜黄素(4μM)共同培养,TRAP染色后计算破骨细胞(≥3个细胞核)生成数目,检测ROS水平,qRT-PCR法检测Cath K和TRAP mRNA表达水平。分析微重力条件对RAW264.7细胞生成、代谢的影响,探讨姜黄素在其中发挥的作用及其机制。4.SD大鼠吊尾模型模拟微重条件(Hind-limb suspension, HLS),经口喂饲SD大鼠姜黄素(40mg/kg. Day)。根据不同处理方法将实验大鼠随机分为四组：(1)非吊尾对照组(Con)；(2)喂食姜黄素的非吊尾对照组(Con+CUR);(3)单纯吊尾实验组(HLS)；(4)喂食姜黄素的吊尾实验组(HLS+CUR)。喂食6周后处死大鼠,经腹主动脉收集全血样本,检测血清维生素D (1,25-(OH)2D3),丙二醛(MDA)水平。5.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,收集尿液检测尿液脱氧吡啶诺林(DPD),尿肌酸酐(CRE)水平。6.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,取大鼠左侧股骨制备骨匀浆,检测骨丙二醛(MDA)水平,总巯基水平(Total sulfhydryl, t-SH)。pRT-PCR (Quantitative real-time PCR analysis)法检骨样本的TRAP、OCN、RANKL、 OPG的mRNA表达水平。pRT-PCR结合Western Blot法检测骨样本中VDR的表达水平。7.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,切取左侧胫骨,选取胫骨近端干骺端制备骨样本,采用双能X线吸收骨密度仪(DEXA)检测骨密度。8.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,切取左侧胫骨,选取胫骨近端干骺端制备骨样本,经脱水、Von Kossa法染色等步骤处理后,使用Bioquant骨组织形态学检测系统对骨标本进行骨组织形态学检测,检测骨表面(Ob.S/BS)、破骨细胞面(Oc.S/BS)。9.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,切取左侧胫骨,选取胫骨近端干骺端制备骨样本,采用micro-CT进行松质骨骨小梁形态学检测,检测参数包括骨小梁容积率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)、骨小梁间隔(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)。10.同方法3模拟微重力处理SD大鼠6周后,制备左侧股骨样本,使用材料测试分析仪进行股骨静力三点弯曲试验,检测极限载荷(Ultimate load)、硬度(Stiffoess)和最大吸收能(Energy absorbtion)生物力学参数。结果1.MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG) MC3T3-E1细胞培养液中ROS含量升高了48.2%(p=0.002),而模拟微重力+姜黄素组(MG+CUR)与单纯模拟微重力组(MG)组相比ROS水平下降了26.6%(p=0.014)。2. MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,检测发现相比于相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG) MC3T3-E1细胞培养液中OPG产量下降了17.5%(p<0.001),而MG+CUR组与MG组相比OPG产量升高了19.9%(p<0.001)；相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG)组RANKL产量明显增加(p<0.001), RANKL/OPG比值显著升高(p<0.001)；而MG+CUR组与单纯模拟微重力组(MG)组相比RANKL产量明显下降(P<0.05),相比于单纯模拟微重力组(MG)组,MG+CUR组RANKL/OPG比值明显下降(p<0.001)。3. MC3T3-E1在RWVB中孵育96 hours后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG) MC3T3-E1细胞的VDRmRNA表达水平下降了68%(p<0.001)和蛋白表达水平下降了72%(p<0.001)；而MG+CUR组与单纯模拟微重力组(MG)组相比,VDRmRNA(p<0.001)表达水平升高了194%而蛋白质表达水平升高了168%(p<0.001)。4. MC3T3-E1细胞在RWVB中孵育养7天后,ALP检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG) MC3T3-E1细胞的ALP活性明显降低(p=0.005),而模拟微重力+姜黄素组(MG+CUR)组与单纯模拟微重力组(MG)组相比ALP活性明显升高(p=0.020)。5.同方法1处理MC3T3-E1细胞后,检测发现相比于Con组,MG组MC3T3-E1细胞ROS水平显著升高(p=0.001),MG组与MG+1,25D组相比无明显差异(p=0.54)；而MG+CUR组和MG+1,25D+CUR组与MG组相比ROS水平显著下降(p=0.006；p=0.001)。而MG+CUR组与MG+1525D+CUR组相比无明显差异(p=0.74)。6.同方法1处理MC3T3-E1细胞后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG) MC3T3-E1细胞培养液中RANKL/OPG值显著升高(p=0.007)；而MG+CUR组、MG+1,25D+CUR组和MG+1,25D与模拟微重力组(MG)相比RANKL/OPG值均显著下降(p=0.01; p=0.009; p=0.005)o MG+CUR组与MG+1,25D相比无明显差异(p=0.55)；MG+CUR组与MG+1,25D+CUR组相比亦无明显差异(p=0.44)。7.同方法1处理MC3T3-E1细胞后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG)MC3T3-E1细胞的ALP活性明显降低(p=0.04),而MG+CUR组、MG+1,25D+CUR组和MG+1,25D与模拟微重力组(MG)相比ALP活性均明显升高(p=0.07; p=0.009; p=0.13)o MG+CUR组与MG+1,25D相比无明显差异(p=0.85)；MG+CUR组与MG+1,25D+CUR组相比亦无明显差异(p=0.54)。8. RAW254.7细胞在RWVB中孵育96 hours后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG)RAW254.7细胞的ROS产量增加160%(p<0.001),而模拟微重力+姜黄素组(MG+CUR)组与单纯模拟微重力组(MG)组相比ROS水平下降39.3%(P<0.05)。9. RAW254.7细胞在RWVB中孵育96 hours后,检测发现相比于正常重力组(Con),模拟微重力组(MG)RAW254.7细胞的CathK和TRAPraRNA表达水平升高明显(p<0.001),而模拟微重力+姜黄素组(MG+CUR)组与单纯模拟微重力组(MG)组相比CathK和TRAPmRNA表达水平明显降低MG组(p<0.001)。10. TRAP染色阳性的多核破骨细胞数目,模拟微重力组(MG)明显高于正常重力组(Con)(3<nuclei<30, p<0.001; nuclei>30, p<0.001),而MG+CUR组TRAP染色阳性性的多核破骨细胞数目明显低于模拟微重力组(MG)(3<nuclei<30, p=0.001; nuclei>30, p<0.001)。11.SD大鼠吊尾实验6周后,检测发现尾吊组(HLS)比目鱼肌/体重比值下降明显(p<0.001)；相比于正常重力组(Con),尾吊组(HLS)引起SD大鼠,食物摄入量下降(p=0.010),体重也显著下降(p<0.001)。12.SD大鼠吊尾实验6周后,检测发现相比于正常重力组(Con),尾吊组(HLS)大鼠胫骨BMD下降明显(p=0.011)；而HLS+CUR组与尾吊组(HLS)相比大鼠胫骨BMD明显升高(p=0.032)。13.SD大鼠吊尾实验6周后,Micro-CT检测发现尾吊组(HLS)大鼠胫骨近端骨松质骨小梁厚度(Tb. Th, trabecular thickness) (p=0.002),骨小梁数量(Tb. N, trabecular number) (p=0.002)、和骨样本骨容积分数(Bone volume fraction, Total volume, BV/TV) (p<0.001)均明显下降,而骨小梁间距(Tb.Sp, trabecular separation)明显升高(p<0.001)；而尾吊+姜黄素组(HLS+CUR)与尾吊组(HLS)相比Tb.Th(p=0.013)、Tb.N(p=0.018)和BV/TV(p=0.008)明显升高,而Tb.Sp下降明显(p<0.001)。14.SD大鼠吊尾实验6周后,骨组织形态学检测发现HLS组胫骨近端骨样本中活跃成骨细胞表面(Ob. S/BS)显著降低(p<0.001),而破骨细胞表面(OC.S/BS)明显升高；而HLS+CUR与HLS相比Ob. S/BS显著升高,而OC. S/BS下降明显(p<0.001)。15.SD大鼠吊尾实验6周后,生物力学检测发现HLS组股骨干极限载荷(Ultimate load) (p=0.007),硬度(Stiffness) (p<0.001),最大吸收能(Energy absorbtion) (p=0.004)均显著降低；而与HLS相比,HLS+CUR组,极限载荷(p=0.027),硬度(p=0.015),最大吸收能(p=0.021)均明显升高。16.SD大鼠吊尾实验6周后,股骨样本qRT-PCR检测发现相比于正常重力组(Con),尾吊组(HLS)大鼠股骨样本TRAP mRNA表达水平明显升高(p<0.001);而与HLS组相比.HLS+CUR组TRAP表达水平下降明显(P>0.05)；尾吊组(HLS)骨钙蛋白(OCN, osteocalcin) mRNA表达水平表达水平显著降低(p<0.001),而与HLS组相比,HLS+CUR组OCN mRNA表达水平升高明显(P>0.05)。相比于Con组,RANKL/OPG mRNA比值,HLS组显著升高(p<0.001),而HLS+CUR组RANKL/OPG mRNA表达水平比值下降(p<0.001)。17.SD大鼠吊尾实验6周后,股骨样本qRT-PCR和Western Blot检测发现HLS组较Con组VDR的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(p<0.001；(p<0.001),而HLS+CUR组与HLS组相比VDRmRNA和蛋白表达水平均明显升高(p<0.001；p<0.001)。18.SD大鼠吊尾实验6周后,检测发现与Con组相比,HLS组和CUR+HLS组血浆1,25-(OH)2D3水平均显著下降(P=0.01；P=0.02)；而HLS组与CUR+HLS相比无明显差异(P=0.55)。19.SD大鼠吊尾实验6周后,HLS组大鼠尿液中尿脱氧吡啶诺林(Deoxypyridinoline, DPD)相比Con组显著升高(p<0.001),而与HLS组相比,HLS+CUR组尿中DPD水平值下降明显(p=0.003)。20.SD大鼠吊尾实验6周后,相比于Con组,股骨样本总巯基(t-SH)水平显著下降(p=0.002)；而HLS+CUR组与HLS组相比,骨样本t-SH水平显著升高(p<0.001)。21.SD大鼠吊尾实验6周后,相比于Con组,HLS组大鼠血浆丙二醛(MDA)水平和股骨样本丙二醛(MDA)水平均明显升高(p=0.003；p=0.006)；而HLS +CUR组与HLS组相比,血浆MDA水平和骨样本MDA水平均显著下降(p=0.011；p=0.017)。结论1.模拟微重力使MC3T3-E1细胞ROS水平升高,抑制细胞的增殖分化能力；而姜黄素能够明显减弱模拟微重力对MC3T3-E1的抑制作用,降低ROS水平,上调MC3T3-E1细胞VDR表达水平。2.模拟微重力条件使RAW254.7细胞ROS水平升高,有利于破骨细胞生成,并使破骨细胞活力增强,而姜黄素能够明显抑制破骨细胞的生成,降低破骨细胞的活力。3、吊尾微重力(HLS)使大鼠骨吸收与骨生成失偶联,骨质丢失明显,而姜黄素能明显减缓模拟微重引发的骨质丢失,其机制可能与其抑制ROS和上调VDR表达水平有关。