论文部分内容阅读
背景中国食管癌(esophageal carcinoma,EC)居所有恶性肿瘤发病率和死亡率的第四位,每年新增EC病例约占全球一半。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是中国EC的主要组织学类型,约占所有EC的90%以上。EC预后极差,主要是由于EC患者确诊时已发生远处转移。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤侵袭和转移密切相关,涉及多个信号转导通路紊乱。TGF-β是一种多功能细胞因子,能够诱导多种组织细胞发生EMT。在肿瘤发生发展过程中,TGF-β具有双重功能,肿瘤发生早期表现为抑制肿瘤功能而晚期阶段则表现为促癌功能。晚期肿瘤组织能够产生大量的TGF-β,诱导肿瘤细胞发生EMT,从而促进癌细胞的侵袭及转移。TAGLN2是钙结合蛋白calponin家族成员,与TAGLN具有高度同源性,主要参与构成胞内应力纤维及肌动蛋白稳定的维系,与细胞分化、迁移、足体形成、细胞浸润和胞外基质重塑等生物学过程密切相关。TAGLN和TAGLN2表达异常见于多种肿瘤,我们已发现ESCC中TAGLN2明显高表达,然而TAGLN2在ESCC中高表达的机制尚不清楚。研究表明:TGF-β诱导的TANLN或TAGLN2表达具有细胞或微环境依赖性。因此,本研究旨在探讨TGF-β诱导的ESCC细胞系EC9706发生EMT过程中,TAGLN2表达变化及生物学功能。目的本研究应用携带TAGLN2特异性沉默序列或无关序列的慢病毒载体感染ESCC细胞系EC9706,建立EC9706 sh TAGLN2及阴性对照EC9706 sh Control亚细胞系,确定TGF-β与TAGLN2促进ESCC恶性演进过程的相关性,探讨TAGLN2在TGF-β信号传导通路中的作用,更深入地理解ESCC发生发展的分子机制。材料与方法1 ESCC细胞系EC9706用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、体积分数5%CO2/95%空气培养箱中培养。2应用携带TAGLN2 sh RNA或阴性对照序列的慢病毒上清感染EC9706细胞,嘌呤霉素筛选建立EC9706 sh TAGLN2或阴性对照的EC9706 sh Control亚细胞系。3用不同浓度TGF-β培养细胞72 h,或用40 ng/m L TGF-β培养细胞不同时间,收集细胞,提取蛋白质,进行后续实验。4 Western印迹:12%SDS-PAGE电泳分离上述蛋白质,转膜,牛奶封闭,孵育一抗、二抗,ECL显色曝光。5 Transwell小室检测细胞体外迁移和浸润能力:将EC9706 sh TAGLN2和EC9706sh Control接种至迁移或侵袭小室中,于37℃培养箱中孵育,结晶紫染色,显微镜下随机选择5个视野计数发生转移细胞数并统计分析。5统计学处理:采用SPSS17.0统计学软件处理,组间比较采用t检验方法,组间计量资料差异比较采用单因素方差分析和重复测量资料检验,检验水准取P=0.05。结果1 TGF-β刺激EC9706 sh Control和EC9706 sh TAGLN2的浓度效应用0-80 ng/m L的TGF-β刺激EC9706 sh Control细胞72 h,TAGLN2的表达随TGF-β浓度增加而逐渐增高,40 ng/m L和80 ng/m L TGF-β诱导的TAGLN2表达量最大;然而,在EC9706 sh TAGLN2细胞中,5~20ng/m LTGF-β不能诱导TAGLN2的表达,但40 ng/m L和80 ng/m L TGF-β均能明显诱导TAGLN2表达,且在80ng/m L浓度时最显著。在浓度效应中,TGF-β刺激对EC9706 sh Control和EC9706 sh TAGLN2的增殖均没有影响(P>0.05)。2 TGF-β刺激EC9706 sh Control和EC9706 sh TAGLN2的时间效应用40 ng/m L TGF-β培养EC9706 sh Control和EC9706 sh TAGLN2细胞,随40 ng/m L TGF-β刺激时间延长,EC9706 sh Control中的TAGLN2的表达逐渐增加,至48 h和72 h表达最高,48 h和72 h的刺激对TAGLN2的诱导并无明显差异;但72 h的TGF-β刺激诱导EC9706 sh TAGLN2中TAGLN2表达无明显增加。在时间效应中,TGF-β刺激对EC9706 sh Control和EC9706 sh TAGLN2的增殖均没有影响(P>0.05)。3 TGF-β诱导EC9706 sh Control细胞发生EMT转化用5~80 ng/m L不同浓度的TGF-β刺激EC9706 sh Control细胞系,随着TAGLN2表达量逐渐增加,间质标志物如N-cadherin、Vimentin等蛋白质表达明显升高,上皮标志物如E-cadherin表达明显降低。TAGLN2沉默能够抑制TGF-β诱导EC9706 sh TAGLN2中间质分子标志物增加(N-cadherin、Vimentin)和上皮标志物(E-cadherin)表达降低。4 TAGLN2沉默抑制TGF-β诱导的体外迁移及浸润能力TGF-β能显著增加EC9706 sh Control细胞迁移或浸润的细胞数(P<0.05),但并不能增加EC9706 sh TAGLN2细胞迁移或浸润的细胞数量。5 TAGLN2沉默抑制TGF-β信号通路下游分子p-Smad2/3活性及MMP-2/9的表达TGF-β能够显著诱导EC9706 sh Control中p-Smad2/3激活,TAGLN2的表达沉默抑制了p-Smad2/3激活及MMP-2的基础表达及TGF-β诱导后表达。结论1 TGF-β可能通过TAGLN2诱导ESCC发生EMT及肿瘤细胞的浸润、转移。2 TAGLN2高表达能够促进ESCC的浸润转移能力,并可能是TGF-β促进ESCC恶性演进过程中的关键分子之一。3 TGF-β可能通过TAGLN2促进ESCC的恶性演进,TAGLN2是ESCC治疗的潜在的分子靶点之一。