【摘 要】
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实验目的壁虎应用于临床抗肿瘤疗效确切,但其抗肿瘤的物质基础仍不明确。本课题拟在前期实验的基础上,进一步借助凝胶过滤、疏水层析、离子层析、超滤等蛋白分离纯化技术,分离得到具有抗肿瘤活性的壁虎蛋白单体。实验方法1、壁虎抗肿瘤蛋白分离纯化方法（1）壁虎粗提液的制备:鲜壁虎匀浆,反复冻融5次后过滤,滤液离心,上清液过0.45μm滤膜,制得壁虎粗提液。（2）硫酸铵分级沉淀:壁虎粗提液进行硫酸铵分级沉淀,得到
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实验目的壁虎应用于临床抗肿瘤疗效确切,但其抗肿瘤的物质基础仍不明确。本课题拟在前期实验的基础上,进一步借助凝胶过滤、疏水层析、离子层析、超滤等蛋白分离纯化技术,分离得到具有抗肿瘤活性的壁虎蛋白单体。实验方法1、壁虎抗肿瘤蛋白分离纯化方法（1）壁虎粗提液的制备:鲜壁虎匀浆,反复冻融5次后过滤,滤液离心,上清液过0.45μm滤膜,制得壁虎粗提液。（2）硫酸铵分级沉淀:壁虎粗提液进行硫酸铵分级沉淀,得到0-40%硫酸铵沉淀组分,并透析除盐。（3）离子交换层析:0-40%硫酸铵沉淀组分经过DEAE-cellulose DE52阴离子层析,收集0.1 MNaCl组分。（4）疏水层析:0.1 MNaCl 组分经过 Phenyl-Sepharose FF疏水层析,收集0M（NH4）2SO4洗脱组分。（5）超滤:0M（NH4）2SO4洗脱组分经过超滤,得到50-100kDa组分。2、各分离组分的活性筛选方法（1）体内:通过灌胃给药于H22荷瘤小鼠（ICR,雌性）模型进行体内抗H22移植性肿瘤活性组分的筛选。（2）体外:通过MTT法检测Bel-7402细胞增殖抑制作用并显微镜下观察Bel-7402细胞形态对分离到的组分进行抗肿瘤活性筛选。3、样品蛋白浓度测定方法Bradford法（考马斯亮蓝法）测定样品中的蛋白质的浓度。4、分离组分的初步纯度鉴定SDS-PAGE、Native-PAGE电泳来观察分析分离组分的纯度。实验结果根据上述实验方法,进行分离纯化及活性筛选,结果如下:1、方法摸索（1）Sephadex G-100凝胶过滤层析将SOURCE 15Q有效0.1M NaCl洗脱组分,进一步通过Sephadex G-100分子筛纯化,分离效果不佳,未采用此方法。（2）Q-Sepharose FF强阴离子交换层析按照本课题组刘建亭的壁虎分离纯化方法,制备50-100 kDa样品组分,选用Q-Sepharose FF强阴离子精细纯化填料,分离效果不理想,未采用此方法。（3）DEAE-Sepharose fast flow 弱阴离子层析壁虎粗提液直接进行DEAE-Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,分离效果不佳,拟在前面增加硫酸铵分级沉淀作为壁虎抗肿瘤蛋白的初级纯化步骤。2、壁虎抗肿瘤活性蛋白的分离纯化（1）硫酸铵分级沉淀体外实验中,20-30%、30-40%、50-60%硫酸铵沉淀组分对Bel-7402细胞的生长表现出显著的抑制作用,抑制率分别为6.99%、6.62%和11.33%;0-20%,80-90%和20-30%组分有促细胞分化作用。体内实验中,硫酸铵沉淀得到0-40%、40-60%和60-90%三部分组分,得率分别为0.0534%、0.4317%和0.3588%,抑瘤率分别为18.30%,23.00%,18.10%,均有显著性差异。（2）DEAE-cellulose DE52硫酸铵沉淀0-40%组分经DEAE-cellulose DE52离子层析分离,收集0.1 M NaCl组分,体内抑瘤实验验证其抗肿瘤活性,抑瘤率达53.33%。（3）Phenyl-Sepharose FF0.1 M NaCl 组分经 Phenyl-Sepharose FF 疏水层析分离,收集 0M（NH4）2SO4 和 H2O的洗脱组分,体内抑瘤率分别为48.14%（P＜0.05）和31.28%（无显著性差异）。（4）超滤0M（NH4）2SO4组分经超滤,分别收集＞100 kDa和50-100 kDa组分,体内抑瘤率分别为 46.00%（P＜0.01）和-7.87%。结论通过硫酸铵分级沉淀、离子层析、疏水层析、超滤等步骤,壁虎粗提液中的活性成分得到了有效地纯化,除去了大部分杂蛋白,最终得到的50-100 kDa活性组分电泳条带较少,推测其分子量在35-45kDa左右。
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