目的肥胖是引起胰岛素抵抗的主要因素,而胰岛素抵抗是肥胖导致2型糖尿病等代谢相关疾病的核心病理机制。对肥胖进行早期干预,不仅能有效改善胰岛素抵抗状态,而且可以防止其进一步发展成为2型糖尿病,同时还对心脑血管事件的发生起到重要预防作用。下丘脑是机体食欲调节的中枢,弓状核中的POMC神经元和NPY神经元通过释放食欲肽,参与机体能量代谢。作为去乙酰化酶,下丘脑SIRT1对其底物Fox O1乙酰化水平的调控与食欲肽有着紧密的联系,在能量平衡中发挥重要作用。本实验以高脂诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠为研究对象,通过观察电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑SIRT1及Fox O1乙酰化水平的影响,及Fox O1不同乙酰化状态下对下游食欲肽表达的作用,探讨电针通过SIRT1/Fox O1信号通路对食欲的中枢调控及改善胰岛素抵抗肥胖的相关机制,为临床应用电针治疗肥胖及胰岛素抵抗相关疾病提供实验依据。方法8周龄SPF级Wistar雄性大鼠90只,随机挑选15只大鼠采用普通饲料进行喂养。8周后,随机挑选10只直接分入正常组。余下75只大鼠采用高脂饲料喂养8周,将造模成功的进行随机编号,并挑选50只随机分入模型组、电针组、假手术组、电针加抑制剂组、激动剂组,每组10只。同时,8周后高脂诱导的IR肥胖大鼠每组各取3只行高胰岛素—正葡萄糖钳夹术以确定胰岛素抵抗模型是否造模成功。分组完成后,将假手术组、电针加抑制剂组、激动剂组行第三脑室置管,术后恢复一周。电针组、电针加抑制剂组大鼠采用电针治疗,取穴为中脘、关元、足三里、丰隆。针刺后连接韩式电针仪,连续波,频率2Hz,强度1m A,每周治疗3次,足三里、丰隆两穴左右交替使用,共治疗8周。假手术组给予第三脑室注射人工脑脊液,电针加抑制剂组给予注射SIRT1特异性抑制剂EX‐527,激动剂组注射SIRT1特异性激动剂SRT1720,接受脑室注射的时间与电针治疗时间一致,正常组与模型组大鼠也在其它组进行电针治疗的同时进行抓取固定。分别在干预前、干预后2、4、6、8周测量所有大鼠的体重、肛鼻长、24小时进食量、Lee’s指数、空腹及餐后血糖。在干预6周后检测各组大鼠的腹腔糖耐量和胰岛素耐量,每组取3只大鼠行高胰岛素—正葡萄糖钳夹术以检测全身胰岛素敏感性。各组大鼠处死前,心尖取血,检测血清胰岛素含量。大鼠处死后,取新鲜下丘脑组织,应用Western Blotting法检测下丘脑SIRT1、Fox O1、Ac‐Fox O1、POMC、NPY的蛋白表达水平,应用RT‐q PCR检测下丘脑SIRT1、Fox O1、Ac‐Fox O1、POMC、NPY的m RNA水平。大鼠灌注固定后取脑,行石蜡切片,应用免疫荧光双标法检测SIRT1/Fox O1、SIRT1/Ac‐Fox O1、Fox O1/POMC、Ac‐Fox O1/NPY在下丘脑弓状核中的蛋白定量及定位,并对上述数据进行统计学分析。结果1.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠体重、进食量、血糖、胰岛素敏感性的影响。所有大鼠体重在干预过程中仍呈上升趋势。与正常组相比,高脂诱导的肥胖模型大鼠体重从干预前到干预结束后均显著升高(P<0.05);2周后,激动剂组体重开始小于模型组(P<0.05);6周后,电针组体重开始小于模型组(P<0.05);8周后,电针组、激动剂组、电针加抑制剂组大鼠体重均低于模型组(P<0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组无统计学差异(P>0.05),激动剂组体重较低(P<0.01)。假手术组体重在整个干预过程中与模型组均无显著性差异(P>0.05)。与正常组相比,肥胖模型大鼠的Lee’s指数在治疗前及整个治疗过程中均显著增高(P<0.05)。经过8周干预,电针组与激动剂组大鼠的Lee’s指数均低于模型组(P<0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组Lee’s指数较高(P<0.05),而激动剂组无差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组进食量显著升高(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组和激动剂组进食量明显下降(P<0.01);与电针组相比,电针加抑制剂组进食量较高(P<0.05),激动剂组进食量较低(P<0.01)。8周实验过程中,各组大鼠各时间段的空腹血糖均无显著性差异。经过8周干预,与正常组相比,模型组餐后血糖显著升高(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组与激动剂组餐后血糖均下降(P<0.05),假手术组与模型组无显著差异(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组与激动剂组血糖均无显著差异(P>0.05)。正常组、电针组、电针加抑制剂组和激动剂组大鼠的血清胰岛素水平明显低于模型组和假手术组(P<0.05),电针组胰岛素水平低于电针加抑制剂组(P<0.05),激动剂组低于电针组(P<0.05)。在IPGTT试验中,所有大鼠空腹状态下血糖无明显差异。电针组和激动剂组的餐后30min血糖上升幅度低于模型组和假手术组(P<0.05),到120min后无显著性差异(P>0.05)。在IPITT试验中,正常组、电针组、激动剂组餐后30min血糖下降幅度明显低于模型组和假手术组(P<0.05),120min后正常组、电针组、激动剂餐后血糖仍明显低于假手术组和模型组(P<0.05)。治疗前(0周),与正常组相比,模型大鼠的GIR显著降低(P<0.01),高脂饲料喂养的各组大鼠GIR无显著性差异(P>0.05)。干预6周后,正常组大鼠GIR无显著变化,电针组和激动剂组大鼠的GIR高于模型组和假手术组(P<0.05),激动剂组GIR高于电针组(P<0.01)。2.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑SIRT1/Fox O1及下游食欲肽蛋白表达的影响。与正常组相比,胰岛素抵抗肥胖大鼠模型下丘脑SIRT1、Fox O1表达显著减少。经8周干预后,与模型组相比,激动剂组下丘脑SIRT1的蛋白表达水平被上调到正常组水平,Fox O1水平亦显著升高(P<0.05);电针组下丘脑SIRT1、Fox O1蛋白表达亦较模型组显著增加(P<0.05);电针加抑制剂组SIRT1蛋白水平亦较模型组有显著增加(P<0.01),但低于电针组(P<0.01),Fox O1水平较模型组升高不明显(P>0.05),但低于电针组(P<0.05);假手术组SIRT1、Fox O1蛋白表达与模型组相比无显著性变化;激动剂组Fox O1高于模型组(P<0.01),与电针组无差异(P>0.05)。各组Ac‐Fox O1的蛋白表达与SIRT1相反,与正常组相比,模型组Ac‐Fox O1表达水平显著增高(P<0.01)。与模型组相比,电针和激动剂显著降低胰岛素抵抗肥胖大鼠Ac‐Fox O1蛋白表达水平,有非常显著性差异(P<0.01);电针加抑制剂组Ac‐Fox O1蛋白表达水平显著降低(P<0.01),但仍高于电针组(P<0.01);假手术组Ac‐Fox O1蛋白表达无显著性变化(P>0.05);激动剂Ac‐Fox O1低于电针组、高于正常组(P<0.01)。正常组下丘脑POMC蛋白含量最高,与正常组相比,模型组和假手术组POMC蛋白含量显著降低(P<0.01)。与模型组相比,激动剂组、电针组、电针加抑制剂组下丘脑POMC蛋白表达水平显著增加(P<0.05),假手术组无显著性差异;与电针组相比,电针加抑制剂组POMC较低(P<0.05),激动剂组无差异(P>0.05)。与正常组比较,模型组NPY蛋白含量显著增高(P<0.01);与模型组相比,激动剂组NPY蛋白表达下降,具有非常显著性差异(P<0.01),电针组NPY蛋白表达较模型组亦减少(P<0.05),电针加抑制剂组和假手术组较模型组无显著性变化(P>0.05);与电针组相比,激动剂NPY减少(P<0.01),电针加抑制剂组无显著差异(P>0.05)。3.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑弓状核SIRT1/Fox O1及下游食欲肽共表达的影响。SIRT1/Fox O1荧光双标结果提示,SIRT1与Fox O1细胞计数呈正相关。与正常组相比,模型组SIRT1和Fox O1表达明显降低(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组SIRT1和Fox O1表达升高(P<0.05),假手术表达无差异(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组SIRT1和Fox O1表达下降(P<0.05),激动剂组无差异(P>0.05)。SIRT1/Ac‐Fox O1荧光双标结果示,SIRT1与Ac‐Fox O1细胞计数呈负相关。与正常组相比,模型组和假手术组Ac‐Fox O1在弓状核表达升高(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组Ac‐Fox O1表达降低(P<0.01),假手术表达无差异(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组Ac‐Fox O1较高(P<0.01),激动剂组较低(P<0.01)。Fox O1/POMC荧光双标结果显示,各组Fox O1与POMC细胞计数呈正相关。与正常组相比,模型组POMC表达量显著下降(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组POMC表达显著上升(P<0.01),假手术表达无差异(P>0.05);与电针组相比,针加抑和激动剂组无统计学差异(P>0.05)。Ac‐Fox O1/NPY荧光双标结果显示,各组Ac‐Fox O1与NPY细胞计数呈正相关。与正常组相比,模型组NPY表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组NPY表达显著下降(P<0.01),假手术表达无差异(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组较低(P<0.05),激动剂组无差异(P>0.05)。4.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑SIRT1/Fox O1通路及下游食欲肽基因表达的影响8周后,与正常相比,模型组SIRT1 m RNA水平显著降低(P<0.01);与模型组相比,电针组无显著差异(P>0.05);假手术组低于模型组(P<0.05);电针加抑制剂组低于假手术组(P<0.05);激动剂组高于模型组(P<0.01),与正常组无差异(P>0.05)。与正常相比,模型组Fox O1 m RNA水平显著亦降低(P<0.01);与模型组相比,电针组、假手术组、激动剂组无显著差异(P>0.05),电针加抑制剂组低于模型组(P>0.05)。与正常组相比,模型组Ac‐Fox O1 m RNA水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,电针组、假手术组、电针加抑制剂组、激动剂组均匀无显著性差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组POMC m RNA水平显著下降(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组均上升(P<0.05),假手术组无显著变化(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组POMC m RNA下降(P<0.01),激动剂组上升(P<0.05)。与正常相比,模型组NPY m RNA水平显著上升(P<0.01);与模型组相比,电针组、电针加抑制剂组、激动剂组均下降(P<0.05),假手术组无显著变化(P>0.05);与电针组相比,电针加抑制剂组和激动剂组NPY m RNA无统计学差异。结论1.电针干预8周后,高脂诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠的体重增长被抑制,进食量减少,Lee’s指数下降,说明电针能够通过抑制摄食达到控制胰岛抵抗肥胖大鼠体重增长的目的。同时,胰岛素抵抗肥胖大鼠的餐后血糖和血清胰岛素水平在电针干预后降低。此外,电针干预6周后,胰岛素抵抗肥胖大鼠的腹腔糖耐量及腹腔胰岛素耐量亦较模型组有明显改善。葡萄糖钳夹术结果显示,电针组大鼠的葡萄糖输注率显著高于模型组。说明电针在改善胰岛素抵抗肥胖大鼠肥胖程度的同时还增加了其胰岛素敏感性。在给予SIRT1抑制剂延第3脑室注射后,电针这种抑制体重增长、减少进食、增加胰岛素敏感性的作用均被不同程度拮抗。单独的应用SIRT1激动剂第3脑室注射也会导致胰岛素抵抗肥胖大鼠出现体重增长抑制、进食减少和胰岛素敏感性增加的结果。说明电针改善肥胖、增加胰岛素敏感性的作用是通过特异性上调SIRT1实现的。2.电针干预8周后,胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑弓状核中SIRT1、FoxO1、POMC的蛋白表达被上调,Ac‐Fox O1、NPY的蛋白表达被下调。电针干预联合SIRT1抑制剂第3脑室注射后,SIRT1、Fox O1、POMC蛋白表达的上调被部分拮抗,Ac‐Fox O1、NPY蛋白表达的下调亦被部分拮抗。单独应该用SIRT1激动剂第3脑室注射同样出现SIRT1、Fox O1、POMC蛋白的上调和Ac‐Fox O1、NPY蛋白的下调。说明电针能够特异性的上调胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑弓状核中SIRT1的蛋白表达,SIRT1的去乙酰化活性随之增强,从而降低Fox O1的蛋白乙酰化水平,导致下游抑食欲肽POMC的蛋白表达增加,促食欲肽NPY的蛋白表达降低,最终达到限制摄食、改善肥胖及胰岛素抵抗的作用。3.电针干预8周后,胰岛素抵抗肥胖大鼠下丘脑中SIRT1、Fox O1、Ac‐Fox O1的m RNA水平较模型组无显著性差异,POMC的m RNA水平被上调,NPY的m RNA水平被下调。电针干预联合SIRT1抑制剂第3脑室注射后,SIRT1、Fox O1的m RNA的水平被明显下调,Ac‐Fox O1与模型组无显著差异,POMC m RNA水平的上调和NPY m RNA水平的下调均被部分拮抗。单独应用SIRT1激动剂第3脑室注射后,SIRT1的m RNA水平被上调,Fox O1、Ac‐Fox O1的m RNA水平与模型组与显著差异,POMC的m RNA水平被上调,NPY的m RNA水平被下调。结果表明,SIRT1抑制剂和激动剂分别能够下调和上调下丘脑中的SIRT1基因表达,而电针对SIRT1的基因表达水平无明显影响。SIRT1去乙酰化活性的增加对Fox O1及Ac‐Fox O1的基因表达水平亦无明显影响,而Fox O1的蛋白乙酰化水平的不同能够调控下游抑食欲肽POMC和促食欲肽NPY的基因表达。说明电针调控食欲改善胰岛素抵抗肥胖的作用靶点在SIRT1的基因转录后调控,而不在基因水平。