乙型肝炎(hepatitis B, HB)是目前广泛流行于世界的传染病,据推测全球HBV携带者数量超过3.5亿,其中5%发生肝癌,约25%~40%发展成肝硬化及重型肝炎,每年死于HBV相关性疾病的患者达1 000~2 000万。随着乙型肝炎疫苗的普遍使用,乙型肝炎的水平传播已基本得到控制,而宫内感染,即HBV经胎盘传播给胎儿引起的感染,新生儿出生后用乙肝疫苗和特异性高效价免疫球蛋白不能阻断其传播,因而成为我国乙型肝炎传播的主要途径。到目前为止,乙型肝炎宫内感染的分子发病机制尚不明确,在治疗上尚未获得突破性进展,因此,HBV宫内感染分子致病机制的研究是迫切需要阐明的、非常重要而艰巨的课题。我国大部分慢性乙型肝炎系宫内感染而来,易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱,从HBsAg携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等,所以宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用。目前感染病的宿主反应性研究日益受到重视,其中HBV感染后的宿主与复杂疾病谱之间的关系成为研究的热门领域。已进行的研究结果显示HBV-宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面,很可能是一个非常复杂的相互作用网络,HBV与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归,而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变。已有的研究结果提示完整的HBV感染肝细胞基因表达谱的研究,有可能使我们更深入地认识HBV的分子致病机制,从而有助于发现更多的、更有效的抗病毒作用靶标。随着分子生物学技术的发展,克隆和鉴定HBV感染肝细胞相关的应答基因成为可能。目前尚未见应用SSH技术分离HBV感染肝细胞后差异应答基因的研究报道。本项研究拟采用SSH技术,研究 HBV感染培养人胎肝细胞后的差异应答基因谱,结合序列分析技术阐明其结构,以期进一步阐明其功能,获得HBV与宿主细胞相互作用的关键因素及HBV感染的分子机制,为发现阻断病毒感染的新途径和抗病毒新靶标奠定基础。我们分离和培养原代22周龄以上胎肝细胞,并将肝细胞和HBV病毒颗粒孵育。应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的<WP=12>HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中 cccDNA。我们比较了几种常用的鉴定HBV感染指标的敏感性和特异性。根据文献报道纤维结合素(fibronectin,FN)作为一种细胞外基质可以促进培养细胞的生长和增殖,人类肝脏血窦FN可以促进肝细胞对HBV病毒的摄取,所以我们用FN包被培养皿了解FN对HBV感染培养人胎肝细胞的影响。HBV成功感染胎肝细胞后我们以感染胎肝细胞作为检测相(tester),以未感染胎肝细胞作为驱动相(driver),用抑制性消减杂交技术检测HBV感染胎肝细胞后差异表达基因,将消减后产生的cDNA片段插入质粒,建立消减cDNA文库,并用斑点杂交法进行筛选。筛选后的差异表达基因进行测序并在GeneBank中进行比较分析。主要结果:1.原代培养人胎肝细胞可以被HBV成功感染。胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2日出现阳性,培养上清和细胞中HBV DNA定量自第4日起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6日出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9日出现阳性。免疫组化检测细胞核中HBcAg最早出现阳性,可以作为一种敏感而简便的检测早期感染的方法,而PCR检测感染肝细胞中的cccDNA出现时间较晚,但经过绿豆芽核酸酶鉴定,特异性高。2.FN可以促进HBV感染离体培养人胎肝细胞。FN包被后HBV感染胎肝细胞的时间提早(未包被时肝细胞中HBcAg自第2日检出,cccDNA自第8日检出,而包被时HBcAg自第1日即可检出,cccDNA自第2日即可检出),感染细胞数量增加(未包被时感染的细胞数量约10%,而包被后感染的细胞数量增加到90%以上)。3.获得仅在检测相表达或比在驱动相表达增高5倍以上的克隆70个,经测序并进行同源性分析显示有16个差异表达cDNA片断。其中5个基因和已知基因片断的同源性为84%~50%,可能为新的cDNA片断,正在进行Northern 杂交鉴定,其他11个cDNA片断和已知基因的同源性为100%。主要创新点:1.比较了几种常用的鉴定HBV感染的方法,发现免疫组化检测细胞核中HBcAg较其它方法敏感,PCR检测 cccDNA经过绿豆芽核酸酶鉴定,特异性高。2.发现纤维结合素FN可以促进HBV感染培养人胎肝细胞。3.用SSH技术分析了胎肝细胞对HBV感染后的差异应答基因谱变化,发现HBV感染胎肝细胞过程可能涉及到物质代谢和信号传导等途径;发现5个可能的新基因片段,其功能尚待进一步明确。 <WP=13>